[發明專利]用于糖多孢菌的轉座質粒及其應用

有效

• 申請號: 201910379905.7
• 申請日: 2019-05-08
• 公開（公告）號: CN111909946B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 陶美鳳;白露露;王業民;鄧子新
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74;C12N15/66;C12N1/21;C12P19/62;C12R1/01
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 莊文莉

本發明公開了用于糖多孢菌的轉座質粒及其應用；該轉座質粒為Tn5轉座質粒—pJTn1～pJTn6，這些轉座質粒均可在紅色糖多孢菌中進行高效轉座，其中pJTn1及pJTn5成功在刺糖多孢菌中進行體內轉座，得到31個插入位點均不同的轉座突變子。通過轉座突變子發酵、檢測發酵液中多殺菌素產量，發現轉座的插入對多殺菌素的產量有明顯的影響。該轉座體系對多殺菌素在刺糖多孢菌中的生物合成調控具有重要意義。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種用于糖多孢菌的轉座質粒及其應用。

背景技術

多殺菌素(spinosad)主要由兩種結構復雜的有機化合物多殺菌素A和D組成，是一種天然產物類生物殺蟲劑，對多種昆蟲有效，常被用于控制多種害蟲，包括薊馬、斑潛蠅、蜘蛛螨、蚊子、螞蟻、果蠅，等等。自1997年美國環境保護局(EPA)將多殺菌素注冊用于殺蟲劑作為農藥使用以來，多個國家已將多殺菌素用于農業生產，用來控制害蟲。

多殺菌素通過分離自土壤的放線菌—刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)發酵生產。野生型刺糖多孢菌的多殺菌素發酵效價很低，通過傳統誘變育種、基因工程育種，結合培養基優化等方法，可以有效地提高多殺菌素的發酵效價，使刺糖多孢菌適于工業規模生產多殺菌素。目前工廠中常用的高產菌種選育方法是多輪隨機誘變篩選，利用物理、化學或生物誘變劑處理野生型菌株產生許許多多的隨機突變株，從大量突變株中篩選獲得產量提高的菌株，再進行下一輪誘變—篩選循環，直到獲得符合要求的高產菌株。基因工程則是新興的技術，通過改造次級代謝物合成的途徑特異性調節基因、多效性調節基因、抗性基因、轉運蛋白基因，消除底物競爭性分支途徑等，都能有效地提高目標化合物的生物合成量，即提高發酵效價。但是，基因工程改良菌種必須建立在確定了有效的候選目標基因的基礎上。轉座誘變是生物學研究中一種有價值的技術，可以創建大量的隨機突變株；其次，轉座誘變產生的突變位點具有易于識別和定位的優點，可以方便快捷地關聯優良突變性狀與發生突變的位點。一旦確定與高產性狀相關的多種基因突變，有望憑借基因工程技術將這些高產突變位點有目的地重組到一個菌株中，快速獲得高產菌株，避免了常規誘變需要做多輪誘變、多輪大量篩選的缺點。

轉座子(Transposon)最早是在上世紀五十年代由Barbara McClintock在研究玉米籽粒顏色變異中發現的，可不依靠同源重組而在基因組內和基因組間使DNA序列發生位置的改變，因此被稱為可移動元件或跳躍基因。以Tn5為例，在生物體內轉座過程為：轉座酶基因表達，轉座酶識別并結合轉座子兩端特異的反向重復序列，將包含反相重復序列及其中間部分的DNA片段切出并插入到新的基因位點，完成轉座過程。在這個過程中造成了新基因位點的插入突變，是一種生物誘變系統。天然發現的轉座子是長期進化選擇的結果，發生轉座的頻率很低。

通過提高轉座酶的催化效率可大幅度提高轉座效率；通過構建mini-Tn5(mini-Tn5，即發生轉座移動的DNA片段內部不含有轉座酶基因)，在外加轉座酶催化發生轉座后，轉走的mini轉座子自身不能表達轉座酶，因此不再發生轉座異位，保障了突變株的遺傳穩定性。用這樣的高效轉座系統可以在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中實現隨機、飽和突變。革蘭氏陽性菌有著厚厚的細胞壁，因此該體系無法在放線菌等革蘭氏陽性菌中直接使用。J.Mark Weber等人利用迂回的體外(In Vitro)轉座誘變方法，先以大腸桿菌為克隆宿主構建了紅色糖多孢菌的基因組粘粒文庫，分別對含候選粘粒的大腸桿菌進行轉座誘變，測序定位突變位點，獲得攜帶轉座子插入突變位點的突變粘粒文庫，再通過原生質體轉化法將突變文庫中的粘粒分別導入紅色糖多孢菌，借助生物體內的同源重組，將突變等位基因交換到紅色糖多孢菌染色體上構建得到突變株，發現了15種基因型與紅霉素的產量相關，包括影響初級代謝和調節基因的突變，以及水解酶，肽酶，糖基轉移酶和未知功能基因。該研究表明，隨機轉座誘變揭示了與菌株改良相關的基因，可能對高產育種有用。但該方法的缺點之一是工作繁瑣繁重：需構建大腸桿菌為宿主的粘粒文庫、轉座誘變大腸桿菌構建粘粒突變體庫、再將突變粘粒分別引入紅色糖多孢菌并篩選雙交換菌株，然后才能篩選表型變化的突變株。由于不能直接在紅色糖多孢菌細胞內轉座，因此很難獲得足夠多的隨機突變株。