[發明專利]切除炭疽芽胞桿菌中pXO1和pXO2質粒的方法

有效

• 申請號: 201910379859.0
• 申請日: 2019-05-08
• 公開（公告）號: CN110055255B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 劉先凱;王東澍;王曉景;馮爾玲;朱力;潘超;王恒樑
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N1/21;C12R1/07
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 魏少偉

本發明公開了切除炭疽芽胞桿菌中pXO1和pXO2質粒的方法。本發明提供的切除炭疽芽胞桿菌中pXO1和pXO2質粒的方法采用CRISPR/Cas9系統進行，CRISPR/Cas9系統中包含名稱分別為sgRNA1和sgRNA2的兩個sgRNA，sgRNA1識別的靶序列為pXO1質粒含有而炭疽芽胞桿菌不含有的特異序列；sgRNA2識別的靶序列為pXO2質粒含有而炭疽芽胞桿菌不含有的特異序列。本發明成功得到了不含有pXO1和pXO2質粒的炭疽芽胞桿菌，構建方法簡單，切除效率高，且一次能篩選到三種不同質粒丟失表型的菌株，為構建新的疫苗株提供了更快捷、更方便新的手段，為炭疽芽胞桿菌的防治提供了新的思路。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中，切除炭疽芽胞桿菌中pXO1和pXO2質粒的方法。

背景技術

炭疽芽胞桿菌(也稱為炭疽芽胞桿菌)是一種革蘭氏陽性、能形成芽胞的需氧桿菌，能夠引起人畜的炭疽病，如果不及時治療，死亡率極高,造成極大經濟損失，威脅生命安全。炭疽芽孢桿菌含有兩個致病相關的毒力大質粒：pXO1(181.6kb)和pXO2(96.2kb)。質粒pXO1編碼保護性抗原、致死因子和水腫因子等炭疽毒素蛋白及它們的調控蛋白。質粒pXO2編碼參與莢膜形成和降解的基因。這兩個質粒對于炭疽芽胞桿菌的致病性至關重要，丟失任何一個質粒都會導致炭疽芽孢桿菌的毒力極大的減低。因此對于炭疽芽胞桿菌毒力大質粒的研究一直是研究的熱點。構建切除毒力質粒的突變菌株對于研究質粒在炭疽芽胞桿菌致病中的作用及與染色體的相關調控非常重要。

早期去除細菌的大質粒可以使用化學試劑，比如吖啶橙、新霉素、溴化乙啶等。高溫培養或紫外照射等方法。但是這些方法都有潛在的問題，第一是特異性差，即在驅除目的質粒的過程中可能驅除目的質粒以外的其他質粒，第二是可能在處理過程中宿主細胞產生隨機突變的可能性。

CRISPR/Cas系統是一類廣泛分布于細菌和古菌基因組中的重復結構，被認為是原核生物防御外來噬茵體、質粒或其他外源DNA侵染的獲得性免疫系統，該系統中的crRNA在一個反式激活crRNA(tracrRNA)的輔助下，募集效應蛋白(Cas蛋白)并把它們帶到靶標DNA序列，Cas蛋白利用其核酸酶的功能切割外源DNA序列，引起DNA雙鏈斷裂(Double StrandBreak,DSB)。目前該系統已經被廣泛利用進行基因編輯。為了更方便簡單的利用該系統，研究人員將II性CRISPR/Cas9系統中的crRNA-tracrRNA雙鏈RNA復合體人工改造為一條嵌合的單鏈RNA，被稱為單向導RNA(single guide RNA，sgRNA)，其5’端20nt(即為spacer序列，這里稱為N20)的特異性的序列配對來靶向DNA位點，靶DNA序列3’末端的PAM(5’-NGG-3’)為Cas9識別位點，不能包含在sgRNA之中。應用的時候只需更換sgRNA的5’末端的N20序列就能夠指導Cas蛋白切割目標DNA序列。2013年該系統率先應用到人類和小鼠胚胎干細胞的基因編輯中，目前已經成功應用到小鼠、豬、食蟹猴、斑馬魚、擬南芥、高粱、煙草、水稻、線蟲、酵母、大腸桿菌等多種動植物和微生物中，成為生物學和醫學各領域廣泛應用的基因編輯工具。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何去除炭疽芽胞桿菌pXO1和pXO2質粒。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了切除炭疽芽胞桿菌中pXO1和pXO2質粒的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系統切除出發炭疽芽胞桿菌中pXO1和pXO2質粒，得到不含有pXO1和pXO2質粒的炭疽芽胞桿菌，所述CRISPR/Cas9系統中包含名稱分別為sgRNA1和sgRNA2的兩個sgRNA，所述sgRNA1識別的靶序列為pXO1質粒含有而炭疽芽胞桿菌不含有的特異序列；所述sgRNA2識別的靶序列為pXO2質粒含有而炭疽芽胞桿菌不含有的特異序列。

所述出發炭疽芽胞桿菌含有pXO1和pXO2質粒。

在本發明的一個實施例中，所述出發炭疽芽胞桿菌為A16。