[發(fā)明專利]抗腫瘤NK細(xì)胞的制備方法及其細(xì)胞與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910376948.X
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN110106202A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃常新;楊麗麗;李永強(qiáng);王聰潔;張嗣玉;高嵐嵐;葛鉆敏;蘇萌
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11562
• 代理人: 宋平

本發(fā)明公開一種轉(zhuǎn)基因NK細(xì)胞的制備方法，步驟：(a)將趨化因子受體基因CCR7基因和CXCR4基因連接到慢病毒載體PHS?BVC?LW238，形成重組基因工程載體；(b)將重組基因工程載體轉(zhuǎn)染所述NK92細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)基因NK細(xì)胞。該轉(zhuǎn)基因NK細(xì)胞能夠良好地抑制腫瘤的生長。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及瘤體趨化的新型高效抗腫瘤NK細(xì)胞及其研制。

背景技術(shù)

近年來，免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣，2014、2015年連續(xù)兩年被評為年度最重要的科學(xué)突破領(lǐng)域，其成就超越了傳統(tǒng)化療、放療和手術(shù)，成為癌癥治療的新手段。包括DC、CAR-T、NK細(xì)胞和免疫檢查點單抗等的腫瘤免疫治療研究越來越深入。

目前認(rèn)為，細(xì)胞免疫治療針對實體腫瘤的療效的制約瓶頸有三：腫瘤缺乏理想的靶點、瘤體組織浸潤的活化免疫細(xì)胞少和腫瘤微環(huán)境免疫抑制。NK細(xì)胞具有強(qiáng)大的天然抗腫瘤和抗感染免疫作用，其抗腫瘤活性無需腫瘤細(xì)胞抗原(靶點)即可識別并攻擊腫瘤細(xì)胞，回避了實體腫瘤細(xì)胞缺乏理想的靶點這一障礙。

NK細(xì)胞具有抗腫瘤、抗感染和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答等功能，NK細(xì)胞不需要特異抗原的刺激，在免疫治療領(lǐng)域有較好的前景。早期利用NK細(xì)胞和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)進(jìn)行免疫治療。

腫瘤細(xì)胞已進(jìn)化出多種機(jī)制來逃避NK細(xì)胞識別，其中包括MHCI類分子和NK抑制性受體配體的表達(dá)。為了克服腫瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶解性的抵抗，提高對腫瘤識別能力，嵌合受體被廣泛研究。其原理：引入嵌合抗原受體將極大避免將抑制性信號傳遞到NK細(xì)胞內(nèi)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤能力。目前，常用基因修飾的方法使NK細(xì)胞表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)特異性的嵌合受體，一旦接觸抗原，嵌合受體信號即可激活NK細(xì)胞。嵌合受體必須引入信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域才能有效增強(qiáng)NK細(xì)胞功能，包括細(xì)胞毒作用和細(xì)胞因子的釋放，最常用的是來自TCR-CD3復(fù)合物的信號結(jié)構(gòu)域。

近年來，NK細(xì)胞因其獨(dú)特優(yōu)勢和作用機(jī)制作為針對腫瘤的免疫治療越來越受到重視[1]，并成為治療癌癥的新型有效手段。NK細(xì)胞在循環(huán)中的相對較短的壽命避免了許多基于T細(xì)胞的免疫療法中常見的危險細(xì)胞因子風(fēng)暴[2]，因而過繼輸注NK細(xì)胞的脫靶毒性很小。NK細(xì)胞的獨(dú)特優(yōu)點是它們可以在沒有特異性抗原識別的情況下殺死腫瘤細(xì)胞，已在多種腫瘤治療上取得一定的效果，如血液腫瘤和黑色素瘤等[3-5]。并且NK細(xì)胞的過繼輸注已成功應(yīng)用于白血病和其他血液腫瘤患者[6-8]。然而，其在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的其他實體瘤中的治療效果并不理想[9,10]。多項研究報道影響NK細(xì)胞過繼免疫治療成敗的關(guān)鍵在于遷移到腫瘤部位的NK細(xì)胞數(shù)量[9,2,1,6]。目前針對NK細(xì)胞腫瘤殺傷的研究主要集中在促進(jìn)其在體內(nèi)生存、體內(nèi)平衡增殖等方面；而促進(jìn)NK細(xì)胞趨化、聚集到腫瘤部位是非常重要的一個環(huán)節(jié)，目前尚未見研究報道。這種研究是臨床NK細(xì)胞免疫治療新興的重要方向[2,11]。

最近的研究表明，細(xì)胞因子激活和體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞缺乏或表達(dá)低水平的趨化因子受體，這意味著NK細(xì)胞上趨化因子受體的表達(dá)量可能對NK細(xì)胞向瘤體趨化這一過程至關(guān)重要。

趨化因子和趨化因子受體在淋巴細(xì)胞向腫瘤遷移中起著重要作用[12]。將NK細(xì)胞有效運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位是癌癥免疫治療成功的關(guān)鍵步驟。通過對NK細(xì)胞免疫治療進(jìn)行臨床I期試驗，Childs RW等發(fā)現(xiàn)一種影響實體瘤患者NK細(xì)胞輸注臨床結(jié)果的重要制約因素是NK細(xì)胞未能足量遷移至腫瘤部位[13]。免疫細(xì)胞可以通過細(xì)胞表面的趨化因子受體與腫瘤分泌的趨化因子相互作用被引導(dǎo)進(jìn)入腫瘤[12]。近年來這些特征在腫瘤免疫治療種得到越來越多的關(guān)注。先前已有給予外源性細(xì)胞因子，或通過轉(zhuǎn)基因提高趨化因子表達(dá)水平，從而促進(jìn)NK細(xì)胞增殖而提高瘤體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量的報道[13]，這種方案的缺點是外源性細(xì)胞因子的全身副作用大，難以控制細(xì)胞因子表達(dá)量，直接作用于NK細(xì)胞的濃度也不高。此外，細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因修飾方式受到主要組織相容性復(fù)合基因MHC分子限制性的控制，使得其應(yīng)用亦受到限制。而通過基因修飾NK細(xì)胞表面的趨化因子受體，既可以避免轉(zhuǎn)基因修飾細(xì)胞因子不足，又可以使免疫細(xì)胞更多的向腫瘤微環(huán)境浸潤，增強(qiáng)抑瘤作用。