[發明專利]一種微生物傳感器的構建方法及其應用方法

在審

• 申請號: 201910376520.5
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN110007072A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 呂雪飛;張靜;鄧玉林;陶慧;楊元展
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京宣言律師事務所 11509
• 代理人: 李知倫

本發明提供了一種微生物傳感器的構建方法及應用方法，步驟一構建待測氨基酸缺陷型菌株；步驟二截取LuxI/LuxR循環放大線路所需目的基因片段連接，得到含有基于LuxI/LuxR系統的循環放大線路的質粒，將重組質粒轉化到氨基酸缺陷型菌株中，使報告基因片段重復表達；步驟三將菌株培養至對數生長期，在培養基中饑餓培養。本發明利用循環放大待測氨基酸缺陷型菌株作為微生物傳感器，以與蛋白質標志物具有高特異性和高親和力結合的核酸適配體作為“橋梁”，將對蛋白標志物的檢測轉化為對待測氨基酸的檢測，利用構建的微生物傳感器實現了對大分子生物標志物的檢測，并且結合循環放大系統作為信號放大手段，大大提高了定量檢測的靈敏度。

技術領域

本發明屬于生物醫學檢測領域，具體涉及一種微生物傳感器的構建方法及其應用方法。

背景技術

生物標志物是在疾病發生過程中發生顯著改變的分子，可以是核酸、蛋白質、代謝物、同工酶或激素等，具有疾病預警、疾病診斷和疾病預后等意義。生物標志物可以客觀地測量和評價正常的生物過程、致病過程或治療性干預的藥理學反應。目前，生物標志物定量檢測方法有酶聯免疫法 (ELISA)、化學發光免疫分析和熒光免疫分析等，這些方法大都需要復雜的儀器、檢測靈敏度相對較低，很難實現低含量生物標志物的有效檢測，難以滿足臨床診斷對生物標志物高靈敏檢測的需求。

微生物傳感器以微生物作為敏感感應元件，結合電化學或光學等換能器，對環境中的某些特殊毒性物質或物理脅迫產生響應反應，將待測信號轉換成具有一定函數關系的便于測量的信號，進而用來定量檢測空氣、土壤或水中的特定化學物質含量及物理脅迫程度。作為敏感元件的微生物具有廉價易培養、生長周期短、具有大量的合成生物學研究基礎等優勢，近年來，合成生物學的快速發展為基因工程微生物的構建提供了一種新方法，并從DNA水平上操控微生物傳感器的選擇性和靈敏度提供了新方向。應用合成生物學技術構建的生物傳感器已經在環境監測、醫學診斷、食品營養、軍事工業等領域取得了進展。如通過將識別特定金屬離子的調節蛋白與下游報告基因的表達聯系起來，構成生物傳感線路，在識別特定金屬離子過程中，調節蛋白或酶活性水平發生改變，通過對信號的檢測，定量環境中的特定金屬離子。

細菌的群體感應(quorum sensing,QS)是依賴信號分子密度識別的一種細胞之間相互交流的通訊機制，可調控基因表達，是細菌胞外信號傳導調控基因表達的生理學過程。很多細菌可以低水平地合成并分泌小分子信號分子(自誘導物)，當信號分子的濃度處于低水平時，不會誘導下游基因的表達，當細菌數量增加，信號分子濃度積累達到閾值時，會誘導下游相關結構基因及自身合成基因的表達，進而產生更高濃度的自誘導物，形成正反饋循環，使信號循環放大，進行群體行為調控。LuxI/LuxR系統是革蘭氏陰性菌典型的群體感應系統，在系統中，LuxI合酶促進自誘導物—酰基高絲氨酸內酯的衍生物(AHL)的合成，LuxR蛋白為調節蛋白，負責識別AHL，可以與AHL結合形成AHL-LuxR復合物，正反饋調節上游啟動子的活性，促進下游LuxI/LuxR蛋白的表達，進一步促進自誘導劑的合成，形成一個正反饋調節機制，構成循環放大線路。

現有的微生物傳感器的設計原理大部分是基于啟動子對于待測物的特異性識別而啟動下游報告基因表達來實現的。要求調節基因/啟動子對目標物具有特定響應才能進行增強表達或啟動，而具有臨床檢測意義的大部分生物標志物都是大分子蛋白質，無法直接進入微生物體內，因此，微生物傳感器多用于小分子物質如重金屬離子、氨基酸等的定量檢測，尚未見諸用于蛋白質等大分子定量檢測的報道。

可以預期以核酸適配體作為特異性識別分子和“橋梁”，將蛋白質生物大分子轉化成氨基酸小分子，通過微生物傳感器轉換成便于定量檢測的熒光信號，通過濃度與熒光強度的線性關系，實現蛋白質生物標志物的定量檢測。因此，基于循環放大系統的微生物傳感器，結合磁珠偶聯競爭的、適配體特異性識別的蛋白質生物標志物定量檢測方法對疾病的早期預測、診斷和預后具有重要的現實意義和臨床應用價值。

發明內容