[發明專利]一種微生物傳感器的構建方法及其應用方法

在審

• 申請號: 201910376520.5
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN110007072A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 呂雪飛;張靜;鄧玉林;陶慧;楊元展
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 北京宣言律師事務所 11509
• 代理人: 李知倫

1.一種微生物傳感器的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一 構建待測氨基酸的缺陷型菌株；

步驟二 構建以熒光蛋白基因為報告基因的質粒，截取LuxI/LuxR循環放大線路所需目的基因片段，連接構建，得到含有基于LuxI/LuxR系統的循環放大線路的質粒，將重組質粒轉化到感受態的由步驟一中獲得的菌株中，使報告基因片段重復表達，獲得具有信號循環放大能力的微生物傳感器；

步驟三 將步驟二中獲得的菌株培養至對數生長期，在培養基中饑餓培養，耗盡菌株中內源性的待測氨基酸分子。

2.根據權利要求1所述的微生物傳感器的構建方法，其特征在于，

其中步驟二包括以下步驟：

步驟二a構建以熒光蛋白基因為報告基因的質粒，提取質粒，轉化到感受態的待測氨基酸缺陷型菌株中，篩選陽性菌落，得到報告基因菌株熒光傳感體系；

步驟二b從質粒載體上雙酶切獲得循環放大線路所需目的基因片段，通過T4 DNA連接酶進行順次連接，完成循環放大線路質粒的構建；

步驟二c將構建完成的質粒轉化到感受態細胞中，涂布對應抗性的LB平板，篩選陽性單克隆；

步驟二d將陽性單克隆接種于對應抗性的液體LB培養基進行擴大培養，然后提取質粒，轉化到感受態的步驟一中獲得的菌株中，涂布對應抗性的LB平板，篩選陽性單克隆，獲得循環放大待測氨基酸缺陷型菌株，即將待測氨基酸信號放大的微生物傳感器。

3.根據權利要求2所述的微生物傳感器的構建方法，其特征在于，在步驟二a后還包括步驟二a1：對報告基因菌株熒光傳感體系進行饑餓培養消耗掉內源性待測氨基酸分子，并檢測報告基因菌株熒光傳感體系對待測氨基酸的響應敏感度。

4.根據權利要求1所述的微生物傳感器的構建方法，其特征在于，還包括步驟四 向微生物傳感器菌液中分別添加具有濃度梯度的待測氨基酸溶液，培養菌液，并分別檢測熒光強度，構建待測氨基酸濃度與熒光強度的工作曲線，檢測微生物傳感器對待測氨基酸的響應敏感度。

5.根據權利要求1所述的微生物傳感器的構建方法，其特征在于，所述熒光蛋白基因為gfp基因、yfp基因、rfp基因或bfp基因中的一種或幾種，所述檢測氨基酸為賴氨酸、甘氨酸、色氨酸、絲氨酸或亮氨酸，所述菌株為大腸桿菌或酵母菌。

6.根據權利要求2所述的微生物傳感器的構建方法，其特征在于，所述所需目的基因片段分別為組成型啟動子Pj23100-RBS、誘導酰基高絲氨酸內酯的受體結合蛋白基因Plux-RBS-luxR、酰基高絲氨酸內酯合成酶基因RBS-luxI和綠色熒光蛋白基因RBS-gfp-T-T。

7.根據權利要求1所述的微生物傳感器的構建方法，其特征在于，所述待測氨基酸為單體氨基酸或多肽。

8.一種應用權利要求1所述的微生物傳感器的蛋白生物標志物定量檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一 根據待測蛋白生物標志物選擇核酸適配體，在磁珠-核酸適配體偶聯物中加入互補鏈，所述互補鏈末端修飾待測氨基酸分子，得到磁珠-核酸適配體-互補鏈的偶聯物；

步驟二 將不同濃度梯度的蛋白生物標志物及待測樣品分別加入到磁珠-核酸適配體-互補鏈的偶聯物中，蛋白標志物與互補鏈競爭結合核酸適配體，蛋白質標志物與核酸適配體結合，釋放出互補鏈；

步驟三 磁分離后，分別向互補鏈游離溶液中加入所述微生物傳感器，進行菌株培養；

步驟四 檢測菌液里的熒光強度，繪制熒光強度與蛋白生物標志物濃度之間的標準曲線，根據標準曲線計算待測樣品中蛋白標志物的濃度。

9.根據權利要求8所述的蛋白標志物定量檢測的方法，其特征在于，所述磁珠-互補鏈偶聯物通過鏈霉親和素-生物素系統偶聯。

10.根據權利要求8所述的蛋白標志物定量檢測的方法，其特征在于，所述互補鏈分子與核酸適配體的左側15nt堿基互補配對。