[發明專利]鑒別雞快慢羽基因型的方法

有效

• 申請號: 201910376463.0
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN110129453B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 李俊英;劉夏儀;鮑海港;吳常信
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

1.用于鑒別雞快慢羽基因型的引物對，其特征在于，包括正向引物F和反向引物R，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和2所示。

2.含有權利要求1所述引物對的檢測試劑或試劑盒。

3.權利要求1所述引物對或權利要求2所述檢測試劑或試劑盒的以下任一應用：

i)用于鑒別雞快慢羽基因型；

ii)用于雛雞雌雄鑒別。

4.用于鑒別雞快慢羽基因型的方法，其特征在于，提取待測雞的基因組DNA為模板，利用權利要求1所述引物對進行PCR擴增，獲得擴增產物，然后用BbvCI內切酶對擴增產物進行酶切，根據酶切產物的片段大小判斷快慢羽基因型。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因型的判斷標準如下：酶切產物出現452bp和499bp兩條特征條帶，為快羽純合基因型；酶切產物僅出現951bp一條特征條帶，為慢羽純合基因型；酶切產物出現452bp、499bp和951bp三條特征條帶，為慢羽雜合基因型。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測酶切后產物片段的大小。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，電泳檢測中瓊脂糖凝膠濃度為1.5～2％；電泳條件為：120～150V，20～25min。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，PCR擴增的反應體系為：2×Taq PCR Mix10μL，ddH₂O 8μL，10μM正向引物F 0.5μL，10μM反向引物R 0.5μL，DNA 1μL；

其中，2×Taq PCR Mix是2倍濃縮的PCR擴增預混合溶液，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs和反應緩沖液；

PCR擴增的反應程序為：95℃ 5min；95℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 1min，30～35個循環；72℃ 7min；4℃保存。

9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，酶切反應體系為：2U/μL酶BbvCI 1～2μL，10×Buffer 3μL，PCR擴增產物5μL，ddH₂O 10μL；酶切反應條件為：37℃，2～3h。

10.根據權利要求4-9任一項所述的方法，其特征在于，基因組DNA的提取方法包括：

1)取5～10μL雞血于1.5mL離心管中，加入600μL血液裂解液，加入20μL蛋白酶K，混勻；56℃消化過夜；

2)加入等體積飽和酚，緩慢顛倒混勻10min，12000rpm離心15min；

3)吸取上清至新離心管中，再加入等體積飽和酚，緩慢顛倒混勻10min，12000rpm離心10～15min；

4)吸取上清至新離心管中，加入等體積的苯酚-氯仿混合液，顛倒混勻10min，12000rpm離心10～15min；其中，苯酚-氯仿混合液中苯酚、氯仿體積比為1：1；

5)吸取上清至新離心管中，加入等體積的氯仿，顛倒混勻10min，12000rpm離心10～15min；

6)吸取上清至新離心管中，加入2倍體積冰乙醇，顛倒混勻，出現白色絮狀沉淀；4℃，12000rpm離心20min；

7)收沉淀，加入1200μL 75％乙醇，4℃，12000rpm離心1h；

8)收沉淀，揮發乙醇；加入50～100μL水，溶解DNA。