[發明專利]利用雙重數字PCR定量檢測芝麻醬和芝麻蓉中花生成分的方法有效
| 申請號： | 201910375468.1 | 申請日： | 2019-05-07 |
| 公開（公告）號： | CN109943627B | 公開（公告）日： | 2022-09-23 |
| 發明（設計）人： | 劉津;高東微;董旭婉;李志勇;董潔;關麗軍 | 申請（專利權）人： | 廣州海關技術中心 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100 | 代理人： | 劉婉 |
| 地址： | 510623 廣東省廣州市*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 利用 雙重 數字 pcr 定量 檢測 芝麻醬 芝麻 花生 成分 方法 | ||
1.一種利用雙重數字PCR定量檢測芝麻醬和芝麻蓉中花生成分的方法，其特征在于：采用雙通道檢測法，利用數字PCR系統同時探測兩種熒光信號，將花生物種特異性基因序列和芝麻物種特異性基因序列檢測的探針分別標記為VIC和FAM，通過在同一PCR反應體系中測得的所述花生物種特異性基因序列和所述芝麻物種特異性基因序列的拷貝數濃度，計算得到花生占芝麻和花生的DNA拷貝數百分比，換算得到花生成分占芝麻和花生成分的質量百分比；
所述方法包括以下步驟：
步驟1.提取芝麻醬或芝麻蓉樣品DNA；
步驟2.設計并合成所述芝麻物種特異性基因序列的引物和探針序列以及所述花生物種特異性基因序列的引物和探針序列；
步驟3.進行雙重數字PCR反應；
步驟4. 采用FAM和VIC雙通道熒光檢測讀取并分析熒光信號；
步驟5.根據熒光信號檢測結果計算所述花生占芝麻和花生的DNA拷貝數百分比，換算得到花生成分占芝麻和花生成分的質量百分比；
其中，所述花生占芝麻和花生的DNA拷貝數百分比，其中a為花生特異性基因拷貝數濃度，b為芝麻特異性基因拷貝數濃度；
其中，所述花生成分占芝麻和花生成分的質量百分比，通過建立其對拷貝數百分比的關系式，利用拷貝數百分比求得；
所述步驟2中，所述芝麻物種特異性基因序列的引物和探針序列如下：
芝麻特異性基因-F：CCAGAGGGCTAGGGACCTTC；
芝麻特異性基因-R：CTCGGAATTGGCATTGCTG；
芝麻特異性基因-P：FAM- TCGCAGGTGCAACATGCGACC -BHQ1；
所述花生物種特異性基因序列的引物和探針序列如下：
花生特異性基因-F：GAGGCAACAGGAGCAACAGTTCAAG；
花生特異性基因-R：CAACGCTGTGGTGCCCTAAGG；
花生特異性基因-P：VIC- GAGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG -BHQ1；
所述雙重數字PCR反應包括ddPCR反應和cdPCR反應；
所述ddPCR反應條件為：95℃，5分鐘，1℃/秒；94℃，15秒，1℃/秒，60℃，1分鐘，1℃/秒，共49個循環；12℃保存反應產物；
所述ddPCR反應體系為20 μL，各組分如下：2×ddPCRTM預混液 10 μL；濃度為10 pmol/μL的引物各0.8 μL，濃度為10 pmol/μL的探針各0.4 μL，DNA模板2 μL，補水至20 μL；
所述cdPCR反應條件為：96℃，10分鐘；60℃，2分鐘，98℃，30秒，49個循環；60℃，2分鐘；10℃保存反應產物；
所述cdPCR反應體系為15 μL，各組分如下：2×QuantStudio? 預混液7.5 μL；濃度為10pmol/μL的引物各0.6 μL、濃度為10 pmol/μL的探針各0.3 μL，DNA模板1.5 μL，補水至15 μL。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1包括將所述芝麻醬或芝麻蓉樣品采用試劑盒法提取樣品DNA。
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