[發(fā)明專(zhuān)利]精神分裂癥小鼠模型海馬circRNA測(cè)序分析及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910375152.2
• 申請(qǐng)日: 2019-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110317866A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張理義
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九0四醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6883
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6883;C12N15/113
• 代理公司: 佛山市智匯聚晨專(zhuān)利代理有限公司 44409
• 代理人: 李海鵬

1.一種精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育小鼠模型海馬生物標(biāo)記物，其特征是，所述標(biāo)記物為circRNA2。

2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育小鼠模型海馬生物標(biāo)記物的檢測(cè)方法，其特征是，包括以下步驟：

腦組織采集，對(duì)照組(NC)、精神分裂癥模型組(SZ)、治療組(Treated)三組小鼠均于100天斷頭處死并剝離全腦；

RNA抽提、建庫(kù)提取樣品總RNA，并使用試劑盒ribo-zero消化核糖體RNA后；加入打斷試劑將RNA打斷成短片段，以打斷后的RNA為模板,用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，在cDNA二鏈合成時(shí)以dUTP代替dTTP,然后連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP的一條鏈進(jìn)行消化，只保留連接鏈不同接頭的cDNA一鏈；使用試劑盒純化cDNA一鏈；純化的cDNA一鏈再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeqTM2500或其他測(cè)序儀測(cè)序；Real-Time PCR(RT-PCR)驗(yàn)證，根據(jù)測(cè)序結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)RNA序列，設(shè)計(jì)circRNA探針及引物；依據(jù)差異倍數(shù)FC≥2、聚類(lèi)分析結(jié)果中處于不同簇、每個(gè)樣本均能檢測(cè)出三個(gè)條件分別挑選小鼠海馬10個(gè)差異circRNA進(jìn)行RT-RCR檢測(cè)，每個(gè)circRNA樣本平行重復(fù)3次；比較NC組和SZ組的表達(dá)差異是否顯著，選取有顯著差異的circRNA再在SZ組和Treated組樣本中進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育小鼠模型海馬生物標(biāo)記物的試劑盒，其特征是，其能夠測(cè)定circRNA2表達(dá)水平。

4.一種精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育小鼠模型轉(zhuǎn)歸的生物標(biāo)記物，其特征是，所述標(biāo)記物為circRNA2。

5.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育小鼠模型轉(zhuǎn)歸的生物標(biāo)記物的檢測(cè)方法，其特征是，包括以下步驟：

取適量抗精神病藥(奧氮平)治療后精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育小鼠模型的海馬組織，從中提取總RNA，并進(jìn)行正太化校正后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反應(yīng)完成后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，得到circRNA2表達(dá)水平；

以選擇經(jīng)過(guò)測(cè)試在所有樣本中可以穩(wěn)定檢測(cè)到的β-Actin作為RT-PCR實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，以ΔCt值(ΔCt＝Cttarget-Ctβ-actin)表示目標(biāo)RNA的相對(duì)表達(dá)水平；使用FPKM法(FragmentsPer kb Per Million Reads)統(tǒng)計(jì)目標(biāo)RNA表達(dá)量；采用NB(負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn))檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)RNA差異顯著性；

通過(guò)建立circRNA2表達(dá)水平的常模，得到標(biāo)準(zhǔn)化值。

6.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種精神分裂癥神經(jīng)發(fā)育小鼠模型轉(zhuǎn)歸的生物標(biāo)記物的測(cè)試劑盒，其特征是，其能夠測(cè)定海馬組織中circRNA2的含量。

7.一種提供circRNA2靶基因網(wǎng)絡(luò)圖及海馬中差異表達(dá)circRNA2的GO/KEGG富集分析結(jié)果。