[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910375110.9
• 申請(qǐng)日: 2019-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110200995B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 明庭紅;蘇秀榕;吳燕;蔣琴琴;郇恒尚;周君;蘆晨陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A61K33/36
• 分類(lèi)號(hào): A61K33/36;A61K9/16;A61K47/42;A61P35/02;C07K14/435;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 寧波奧圣專(zhuān)利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球的制備方法及其應(yīng)用，特點(diǎn)是包括以下步驟：（1）依次通過(guò)基因擴(kuò)增、原核表達(dá)載體的構(gòu)建和原核表達(dá)以及蛋白純化獲得基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白；（2）將基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白置于透析袋中，在5 mM亞砷酸鈉溶液中進(jìn)行透析，整個(gè)富集過(guò)程中使用磁力攪拌器模擬流動(dòng)液體，透析12 h后，將透析袋置于蛋白緩沖液中透析12 h，期間每隔4 h更換一次蛋白緩沖液，取出透析袋中的蛋白溶液經(jīng)濃縮后，得到基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球，優(yōu)點(diǎn)是對(duì)慢性粒細(xì)胞白血細(xì)胞K562細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用重組鐵蛋白制備重金屬納米球，尤其是涉及一種基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

星蟲(chóng)、紐蟲(chóng)、泥蚶、縊蟶、仿刺參和海地瓜是經(jīng)濟(jì)無(wú)脊椎動(dòng)物的代表。它們是典型的底棲生物，能耐受環(huán)境中較高濃度的重金屬，這一特性與其體內(nèi)鐵蛋白對(duì)重金屬的富集功能密不可分。因此，研究這些無(wú)脊椎動(dòng)物富集重金屬的生物功能，為在生物醫(yī)學(xué)和材料化學(xué)以及生物納米技術(shù)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能性。近年來(lái)，已有利用鐵蛋白進(jìn)行靶向給藥。

慢性粒細(xì)胞白血病是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性腫瘤，常伴有白細(xì)胞異常增生及分化成熟障礙，其發(fā)病率和死亡率在兒童和青少年的惡性腫瘤中位居首位。該疾病的生物學(xué)特征是造血細(xì)胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡過(guò)程發(fā)生障礙、異常分化的細(xì)胞大量增殖。目前臨床上常用的白血病細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑有砷劑、維甲酸及其衍生物等。砷劑是人類(lèi)歷史上最早被用于腫瘤治療的藥物之一，但由于其毒副作用明顯，砷劑在抗腫瘤上的應(yīng)用也逐漸被人們放棄。20世紀(jì)70年代，我國(guó)學(xué)者張亭棟團(tuán)隊(duì)采用現(xiàn)代科學(xué)的給藥方式，以砒霜（As₂O₃）為主要成分制成“癌靈”注射液，對(duì)急性粒細(xì)胞性白血病的治療取得開(kāi)創(chuàng)性成果。亞砷酸鈉作為一種無(wú)機(jī)砷劑，其能通過(guò)誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。但由于低劑量的砷劑治療效果不夠理想，而較高的劑量對(duì)正常細(xì)胞有較大毒副作用，會(huì)引起死亡。為了發(fā)揮亞砷酸鈉治療白血病的效果減少毒副作用，本發(fā)明基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白富集重金屬的特性，將亞砷酸鈉制成納米砷球用于治療白血病。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)慢性粒細(xì)胞白血細(xì)胞K562細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用的基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球的制備方法，包括以下步驟：

（1）基于無(wú)脊椎動(dòng)物重組鐵蛋白的制備

A．鐵蛋白基因序列的克隆

a．多個(gè)砷結(jié)合位點(diǎn)的基因擴(kuò)增

以Fer147基因序列作為模板，該基因序列為SEQID NO.1所示的cDNA序列，設(shè)計(jì)上游擴(kuò)增引物FER-F：5′- CCGCTCGAGAATTAGGAGGAAGTCCAAGA-3′；和下游擴(kuò)增引物FER-R：5′-CGCCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3′，PCR擴(kuò)增Fer147目的基因，利用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，得到Fer147目的基因；

b．原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用Nde I和Xho I兩種限制性?xún)?nèi)切酶分別對(duì)Fer147目的基因和pET-28a(+)表達(dá)載體進(jìn)行酶切，然后利用膠回收試劑盒分別對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收純化；利用DNA連接酶將酶切后的Fer147目的基因片段與pET-28a(+)空載質(zhì)粒進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)平板篩選PCR擴(kuò)增及測(cè)序比對(duì)后，得到含有目的基因的陽(yáng)性克隆子菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，得到含有Fer147的重組表達(dá)載體；所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)平板篩選PCR擴(kuò)增，得到含有目的基因的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株；

c．原核表達(dá)