[發明專利]一種基于無脊椎動物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201910375110.9
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN110200995B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 明庭紅;蘇秀榕;吳燕;蔣琴琴;郇恒尚;周君;蘆晨陽
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: A61K33/36
• 分類號: A61K33/36;A61K9/16;A61K47/42;A61P35/02;C07K14/435;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

1.一種基于無脊椎動物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)基于無脊椎動物重組鐵蛋白的制備

A.鐵蛋白基因序列的克隆

a.基因擴增

以Fer147基因序列作為模板，該基因序列為SEQ ID NO.1所示的cDNA序列，設計上游擴增引物FER-F：5′-

CCGCTCGAGAATTAGGAGGAAGTCCAAGA-3′；和下游擴增引物FER-R：5′-CGCCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3′，PCR擴增Fer147目的基因，利用膠回收試劑盒對PCR產物進行回收和純化，得到Fer147目的基因；

b.原核表達載體的構建

利用Nde I和Xho I兩種限制性內切酶分別對Fer147目的基因和pET-28a(+)表達載體進行酶切，然后利用膠回收試劑盒分別對酶切產物進行回收純化；利用DNA連接酶將酶切后的Fer147目的基因片段與pET-28a(+)空載質粒進行連接后，轉化到感受態細胞DH5α中，經平板篩選PCR擴增及測序比對后，得到含有目的基因的陽性克隆子菌落，擴大培養后，利用質粒提取試劑盒提取質粒，得到含有Fer147的重組表達載體；所得重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，經平板篩選PCR擴增，得到含有目的基因的大腸桿菌BL21表達菌株；

c.原核表達

將含有目的基因的大腸桿菌BL21表達菌株按體積比1:50的比例分別接種于10mL含有30μg/mL卡那霉素LB培養基，37℃，120rpm培養至OD₆₀₀＝0.6，添加終濃度為0.5mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)于培養基中，搖床轉速為125rpm，分別在溫度為20℃條件下誘導18h和溫度為37℃誘導5h；所得菌液于6500rpm離心15min收集菌體，棄上清培養基，菌體用2mL破碎緩沖液懸浮，經超聲破碎后的溶液于12000rpm冷凍離心機離心10min，收集上清；取40μL上清液加入10μL 5×蛋白上樣緩沖液，充分混勻，放入100℃的金屬浴中加熱處理10min，再低速離心30s，收集蛋白上清液即為含有目的基因蛋白Fer147的上樣液；

B.蛋白純化

將裝有填料的鎳柱連接在蛋白純化系統上，用蛋白緩沖液對鎳柱進行沖洗；將離心好的蛋白上清溶液流經鎳柱后，用蛋白洗滌緩沖液Ⅰ對鎳柱中的雜蛋白進行沖洗，直至蛋白純化儀檢測到的信號下降到平穩狀態；隨后用蛋白洗滌緩沖液Ⅱ對目的蛋白進行洗脫，當蛋白純化儀檢測到信號有上升趨勢時，洗脫下來的溶液為需要收集的蛋白溶液，收集洗脫液，直到信號下降到基線平穩狀態；將收集的含有目的蛋白的洗脫液置于30kD的超濾管濃縮，轉速控制在3000-3500rpm，離心過程中用蛋白緩沖液進行多次交換，以去除殘留的高濃度咪唑，最后將蛋白溶液濃縮到呈淺橙黃色為止；在濃縮的蛋白中加入適量的SUMO酶，至于4℃環境中酶切過夜，酶切后的混合溶液通過鎳柱再次純化，取流穿液，即酶切后不帶標簽的目的蛋白，即基于無脊椎動物重組鐵蛋白；

(2)重金屬的富集

將基于無脊椎動物重組鐵蛋白置于透析袋中，在5mM亞砷酸鈉溶液中進行透析，整個富集過程中使用磁力攪拌器模擬流動液體，透析12h后，將透析袋置于蛋白緩沖液中透析12h，期間每隔4h更換一次蛋白緩沖液，以除去未被重組蛋白吸附的重金屬離子，取出透析袋中的蛋白溶液經濃縮后，得到基于無脊椎動物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球，其中所述的破碎緩沖液的配方為25mM Tris，150mM NaCL，pH 8.0，0.5％triton X-100；所述的蛋白緩沖液的配方為25mM Tris，150mM NaCl，pH 8.0；所述的蛋白洗滌緩沖液Ⅰ的配方為25mM Tris，150mM NaCl，50/70/100mM咪唑，pH 8.0；所述的蛋白洗滌緩沖液Ⅱ的配方為25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0。

2.一種權利要求1制備的基于無脊椎動物重組鐵蛋白的抗腫瘤納米砷球在制備慢性粒細胞白血細胞K562抑制劑方面的應用。