[發明專利]一種構建冠狀病毒感染性克隆的方法及其應用

有效

• 申請號: 201910373562.3
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110079541B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 謝青梅;封柯宇;邵冠明;張新珩;邵洋洋
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/86;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 北京惠科金知識產權代理有限公司 11981
• 代理人: 瞿曉晶

本發明公開了一種構建冠狀病毒感染性克隆的方法及其應用，首先是獲得覆蓋所選冠狀病毒全長基因組的cDNA小片段，然后進行分段克隆，再使用RED/ET重組技術將含有冠狀病毒全長基因組的cDNA小片段組裝到質粒載體上，篩選獲得含有該冠狀病毒全長cDNA的感染性克隆。其有益效果在于，本發明首次利用中低拷貝的質粒載體成功構建了雞傳染性支氣管炎病毒感染性克隆，為冠狀病毒的感染性克隆的構建開辟了新途徑，該方法解決了冠狀病毒載體選擇困難和病毒大基因組在細菌中不穩定的問題，陽性克隆率高，且獲得的反向遺傳疫苗株克隆具有完整性、傳代穩定性和感染性，拯救效率高，為研究冠狀病毒的致病機理和開發新型疫苗等提供了有效工具。

技術領域

本發明屬于動物基因工程技術領域，更具體地，涉及一種構建冠狀病毒感染性克隆的方法及其應用。

背景技術

反向遺傳學技術是通過構建病毒感染性分子克隆，在DNA水平上進行分子操作，從而研究病毒的結構與功能的方法，由于冠狀病毒基因組較大，很難有合適的載體能夠容納如此龐大的基因組來獲得病毒。因此冠狀病毒基因組的研究一直局限于溫度敏感突變株、缺陷病毒以及利用靶向RNA同源重組技術構建的重組病毒，其中靶向RNA同源重組技術是最早用于冠狀病毒反向遺傳學研究的技術，后來出現了基于痘苗病毒載體和細菌人工染色體(BAC)的冠狀病毒反向遺傳操作技術，BAC載體具有容量大(理論300kB)，拷貝低(1～2拷貝/E.coli)的特點。目前已報道基于BAC載體構建成功的冠狀病毒感染性克隆包括TGEV、SARS-CoV、HCoV-OC43、MERS-CoV和FIPV。然而BAC載體的缺點也是顯而易見的，由于拷貝數太低，需要培養大量菌液。BAC提取工作量較大。

對于中低拷貝的質粒載體的冠狀病毒感染性克隆，目前還沒有構建成功的報道。除了質粒載體容量的原因，最主要原因在于冠狀病毒基因組較大并且含有對于E.coli具有毒性的序列，其基因組cDNA克隆在大腸桿菌中不穩定，經常造成一些片段的突變或丟失，并且隨著質粒拷貝數的增加，這種不穩定性更加明顯。因此限制了中低拷貝的質粒在冠狀病毒感染性克隆上的應用。

雞傳染性支氣管炎是一種因傳染性支氣管炎病毒造成的高度接觸性、急性及病毒性的呼吸道疾病。臨床上的主要癥狀是打噴嚏、咳嗽及啰音、腎炎、產蛋率及蛋品質下降等癥狀。且感染不同日齡或者不同種類的家禽引發的影響不同，主要導致呼吸系統、腎臟、生殖系統等方面的疾病的發生，引發的死亡率較高，從而造成很大的經濟損失。

傳染性支氣管炎病毒(IBV)是較為典型的冠狀病毒，具有囊膜，是目前已知的RNA病毒中基因組最大的單股正鏈RNA病毒。該病毒結構蛋白包括核衣殼蛋白，纖突蛋白、小膜蛋白和膜蛋白。由于IBV的RNA聚合酶缺乏校正功能，且纖突蛋白的多變性，并且其基因組復制方式極易發生重組，導致IBV極易發生變異，從而產生新的毒株、基因型或血清型。目前世界范圍內報道的IBV毒株至少可以分為30種基因型或血清型。其中Mass型主要包括M14、H52和H120。

雞傳染性支氣管炎的防制主要為疫苗接種，傳統疫苗在安全性、有效性以及成本等方面都存在一定的缺陷，已經研究的基因工程疫苗中亞單位疫苗免疫效果不如傳統疫苗，利用基因工程技術的活載體疫苗在表達外源抗原上具有靈活的可操作性，而且能夠有效地傳遞抗原，但目前作為疫苗活載體只有小RNA病毒，例如，新城疫病毒載體和豬繁殖與呼吸綜合征病毒載體。

發明內容

本發明針對于以上問題，提供一種利用中低拷貝的質粒載體構建冠狀病毒感染性克隆的方法，克服了現有技術中冠狀病毒cDNA在細菌中不能穩定保存的問題，克服了傳統方法酶切連接效率低，拯救率低的問題，克服了傳統方法不能獲得完整全基因組的問題，所述方法包括以下步驟：

S1：提取該冠狀病毒的RNA，反轉錄獲得cDNA；

S2：將步驟S1所得cDNA片段化，得到包含cDNA全基因的各片段，其中所述片段的首片段包括T7啟動子，所述各片段相鄰兩片段間含有50～70bp重疊區域作為重組同源臂，所述片段化的方法包括酶切或PCR擴增；