[發(fā)明專利]一種構(gòu)建冠狀病毒感染性克隆的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910373562.3
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110079541B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝青梅;封柯宇;邵冠明;張新珩;邵洋洋
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/86;A61K39/215;A61P31/14
• 代理公司: 北京惠科金知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11981
• 代理人: 瞿曉晶

1.一種雞傳染性支氣管炎病毒感染性克隆的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

SS1：提取雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株的RNA，轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；

SS2：以步驟SS1所述cDNA為模板，PCR擴(kuò)增包含T7啟動子和雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株全基因的A、B、C、D四個片段，以基因合成的pUC47-HDVR-T7ter為模板，擴(kuò)增包含丁型肝炎病毒核酶序列(HDVribozyme)及T7終止子(T7terminator)的片段E；

所述片段A采用引物H120-A-F/R擴(kuò)增獲得；所述片段B采用引物H120-B-F/R擴(kuò)增獲得；所述片段C采用引物H120-C-F/R擴(kuò)增獲得；所述片段D采用引物H120-D-F/R擴(kuò)增獲得；所述片段E采用引物HDV-T7ter-F/R擴(kuò)增獲得；

所述引物序列為：

SS3：將線性質(zhì)粒pBR322為模板，與步驟SS2中A、B、C、D四個片段分別同源重組，得到分別包含A、B、C、D片段的重組質(zhì)粒；

SS4：選取步驟SS3所得包含D的重組質(zhì)粒，將其中部分堿基做同義突變，記為突變片段載體pDt；

SS5：以質(zhì)粒p15A-cm-ccdB為模板，擴(kuò)增得到用于感染性克隆組裝的線性載體p15A-cm，酶切步驟SS3和SS4中重組質(zhì)粒，獲取A、B、C和Dt片段，將片段A、B、C、Dt、E和線性載體p15A-cm共轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞GBdirE.coli中，抗性篩選獲得陽性克隆；

SS6：以步驟SS1所得cDNA為模板，擴(kuò)增得到的N基因再與質(zhì)粒pVAX1同源重組，構(gòu)建得到表達(dá)N基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-N；

SS7：將步驟SS6所述表達(dá)N基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-N與步驟SS5所得陽性克隆共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，能成功拯救獲得雞傳染性支氣管炎病毒反向遺傳株的陽性克隆即為含有該雞傳染性支氣管炎病毒全基因組的感染性克隆；

所述雞傳染性支氣管炎病毒疫苗株為H120。

2.一種利用權(quán)利要求1所述構(gòu)建方法得到的雞傳染性支氣管炎病毒感染性克隆。

3.一種權(quán)利要求2所述雞傳染性支氣管炎病毒感染性克隆在制備載體疫苗中的應(yīng)用。