[發(fā)明專利]以高分辨率熔解曲線為基礎(chǔ)的三帶喙庫(kù)蚊鑒定試劑盒及其鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910373361.3
• 申請(qǐng)日: 2019-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110029176B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 滕新棟;陳曉光;程曉蘭;侯偉;梁潔;張瑾;鄭健;張濤;姜華;劉海江;朱可;徐翮飛;張娟;郭寧;顧長(zhǎng)美
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（青島海關(guān)口岸門診部）
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京知企鴻蒙專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11692
• 代理人: 劉帥帥

本發(fā)明涉及一種物種鑒定領(lǐng)域，是一種以高分辨率熔解曲線為基礎(chǔ)的三帶喙庫(kù)蚊鑒定試劑盒及其鑒定方法，其特點(diǎn)是根據(jù)三帶喙庫(kù)蚊COIII基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用優(yōu)化的高分辨率熔解曲線反應(yīng)體系鑒定三帶喙庫(kù)蚊各種形態(tài)如成蟲(chóng)、卵、幼蟲(chóng)和蛹等。能對(duì)三帶喙庫(kù)蚊進(jìn)行鑒定，操作簡(jiǎn)單、速度快、PCR產(chǎn)物無(wú)需后處理、可以檢測(cè)出單個(gè)堿基的差異、真正實(shí)現(xiàn)閉管操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以高分辨率熔解曲線為基礎(chǔ)的三帶喙庫(kù)蚊鑒定試劑盒及其鑒定方法。

背景技術(shù)

口岸蚊類種群鑒定主要手段為形態(tài)學(xué)鑒定，依靠有形態(tài)學(xué)鑒定經(jīng)驗(yàn)和蚊類形態(tài)鑒定能力的口岸檢驗(yàn)檢疫人員，根據(jù)醫(yī)學(xué)蚊類分類檢索表進(jìn)行鑒定。然而，形態(tài)學(xué)鑒定面臨很多問(wèn)題：蚊類專業(yè)鑒定人才少，人員培養(yǎng)周期長(zhǎng)；鑒定人員的經(jīng)驗(yàn)程度、專業(yè)水平、蚊類完整性與發(fā)育階段等因素可導(dǎo)致鑒定周期長(zhǎng)，效率低；一些復(fù)雜的種群如近緣種群和同形種群難以鑒定；對(duì)于蚊類卵、幼蟲(chóng)和蛹，為獲取其可靠鑒定特征，經(jīng)常需要蚊類人工培養(yǎng)后鑒定；口岸送檢蚊類若數(shù)量較大，對(duì)口岸蚊類鑒定工作是非常大的考驗(yàn)；等等。因而，口岸蚊類鑒定除了提高檢疫人員鑒定能力和研發(fā)鑒定輔助系統(tǒng)外，仍需要發(fā)展安全、快速、準(zhǔn)確、靈敏的鑒定方法，以實(shí)現(xiàn)蚊類快速鑒定。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，常規(guī)PCR、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、DNA條形碼技術(shù)等分子手段已經(jīng)應(yīng)用于蚊類種群鑒定。然而，這些鑒定方法均有不足之處：常規(guī)檢測(cè)特異PCR產(chǎn)物序列，依賴于較貴的分子探針或產(chǎn)物測(cè)序；RFLP鑒定蚊種不僅耗時(shí)，而且需要大量樣本；RAPD鑒定蚊種快速，但結(jié)果不穩(wěn)定，且有時(shí)不可重復(fù)；SSCP只能作為檢測(cè)蚊類基因突變的方法，要確定突變的位置和類型，需進(jìn)一步測(cè)序，且電泳條件要求比較嚴(yán)格；DNA條形碼技術(shù)的后續(xù)測(cè)序工作耗時(shí)、耗經(jīng)費(fèi)。鑒于上述方法的不足，為了安全、快速、準(zhǔn)確、靈敏的實(shí)現(xiàn)蚊類種群的分子鑒定，需要探尋新的分子鑒定手段。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供一種以高分辨率熔解曲線為基礎(chǔ)的三帶喙庫(kù)蚊鑒定試劑盒及其鑒定方法可作為三帶喙庫(kù)蚊新的鑒別手段，它以單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線為基礎(chǔ)進(jìn)行蚊類鑒定，操作簡(jiǎn)單、速度快、低成本、高通量、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測(cè)位點(diǎn)的局限、PCR 產(chǎn)物無(wú)需后處理、可以檢測(cè)出單個(gè)堿基的差異等優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)真正的閉管操作從而降低污染風(fēng)險(xiǎn)，非常適合大量樣品的分析。

本發(fā)明是由以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一組以高分辨率熔解曲線為基礎(chǔ)的三帶喙庫(kù)蚊特異性鑒定引物，序列如下：

COIII-F：5’- CGATGAGGAATAATTTTATT -3’

COIII-R：5’- CAGTAAAGAATAAACTTTGAG -3’。

利用上述的檢測(cè)引物，本發(fā)明提供一種以高分辨率熔解曲線為基礎(chǔ)的三帶喙庫(kù)蚊鑒定試劑盒，它包括如成分：

1）三帶喙庫(kù)蚊COIII基因的特異性引物

COIII-F：5’- CGATGAGGAATAATTTTATT -3’

COIII-R：5’- CAGTAAAGAATAAACTTTGAG -3’。

2）PCR混合液：FastStart Taq DNA聚合酶，反應(yīng)緩沖液，dNTP混合液，ResoLight飽和熒

光染料；

3）三帶喙庫(kù)蚊基因組；

4）ddH2O；

5）25 mM MgCl2。

本發(fā)明還提供一種以高分辨率熔解曲線為基礎(chǔ)的三帶喙庫(kù)蚊方法，包括如下步驟：