[發明專利]以高分辨率熔解曲線為基礎的三帶喙庫蚊鑒定試劑盒及其鑒定方法有效
| 申請號： | 201910373361.3 | 申請日： | 2019-05-07 |
| 公開（公告）號： | CN110029176B | 公開（公告）日： | 2023-01-03 |
| 發明（設計）人： | 滕新棟;陳曉光;程曉蘭;侯偉;梁潔;張瑾;鄭健;張濤;姜華;劉海江;朱可;徐翮飛;張娟;郭寧;顧長美 | 申請（專利權）人： | 青島國際旅行衛生保健中心（青島海關口岸門診部） |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京知企鴻蒙專利代理事務所(普通合伙) 11692 | 代理人： | 劉帥帥 |
| 地址： | 266071 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 高分辨率 熔解 曲線 基礎 三帶喙庫蚊 鑒定 試劑盒 及其 方法 | ||
1.一種以高分辨率熔解曲線為基礎的三帶喙庫蚊COIII基因鑒定方法，其特征是，包括如下步驟：
1）高分辨率熔解曲線模板三帶喙庫蚊基因組DNA的制備
使用電動勻漿器低溫研磨三帶喙庫蚊組織；使用TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒，參照試劑盒說明提取三帶喙庫蚊基因組DNA；
2）高分辨率熔解曲線反應體系：
30μL反應體系包括：FastStart Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板2μL，dNTP混合液2μL，ResoLight飽和熒光染料1μL，COIII-F引物1μL，COIII-R引物1μL，反應緩沖液3μL，25mMMgCl2 3.6μL，ddH2O 15.9μL；
COIII-F和COIII-R序列如下：
COIII-F：5’- CGATGAGGAATAATTTTATT -3’；
COIII-R：5’- CAGTAAAGAATAAACTTTGAG -3’；
3）高分辨率熔解曲線反應程序：
94℃預變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸5min；
PCR結束后直接運行高分辨率熔解曲線，95℃變性1min，40℃降溫1min，65-95℃連續升溫，每次升溫1℃，收集25個熒光信號；40℃冷卻10s，使用LightCycler? 480 GeneScanning Software 軟件分析高分辨率熔解曲線；橫坐標為溫度，縱坐標為相對熒光強度，其中有波動的曲線為三帶喙庫蚊，直線的曲線為對照蚊種。
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