[發(fā)明專(zhuān)利]與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體及利用SELEX篩選方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910371702.3
• 申請(qǐng)日: 2019-05-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110423754A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓芹芹;靖樂(lè);夏雪山;宋玉竹;張金陽(yáng);王炳輝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/115
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/115;C12Q1/6806;G01N33/53
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體及利用SELEX篩選方法和應(yīng)用，所述的核酸適配體是單鏈DNA，由82個(gè)核苷酸組成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其二級(jí)結(jié)構(gòu)含有突出的環(huán)和莖，其中Bor?B02吉布斯自由能DG＝?11.90。基于酶聯(lián)寡核苷酸吸附測(cè)定法進(jìn)行核酸適配體特異性、親和力和靈敏度等一系列性質(zhì)評(píng)估，顯示Bor?B02解離常數(shù)Kd＝21.64±2.732nM，且能特異性與硼砂結(jié)合，因此該核酸適配體具有高特異性、高親和力的特點(diǎn)，可用于后續(xù)對(duì)硼砂的快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體及利用SELEX篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

硼砂，一般寫(xiě)作Na2B₄O₇·10H₂O，是非常重要的含硼礦物及硼化合物，通常為無(wú)色晶體的白色粉末，易溶于水。硼砂可用作清潔劑、化妝品、殺蟲(chóng)劑，也可用于配置緩沖溶液和制取其他硼化合物等。硼砂的毒性較高，是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，對(duì)人體的胃、腎臟、肝臟、腦和皮膚損害極大，硼砂的成人中毒劑量為1-3克，成人致死量為15克，嬰兒致死量為2-3克。人體若攝入過(guò)多的硼砂，會(huì)引發(fā)多臟器的蓄積性中毒。長(zhǎng)期過(guò)量攝入硼砂，對(duì)人體生殖、發(fā)育和內(nèi)分泌系統(tǒng)有毒性影響。短時(shí)間攝入大劑量硼砂，可能導(dǎo)致急性中毒，輕者引起頭暈、頭痛、食欲不振、消化不良、體重減輕等癥狀；嚴(yán)重者出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、休克、昏迷等中毒表現(xiàn)。硼砂中毒者的病理檢查可見(jiàn)胃、腎臟、肝臟、腦和皮膚出現(xiàn)非特異性病變，主要有肝臟充血、脂肪變性、肝細(xì)胞混濁腫脹；腎呈彌漫性水腫，腎小球和腎小管均有損害；腦和肺出現(xiàn)水腫。不法生產(chǎn)者和商販為了增加食品的韌性、脆度口感，或延長(zhǎng)保存期限，往往會(huì)在食品的加工過(guò)程中違法添加硼砂。由于硼砂的強(qiáng)致癌性和較強(qiáng)毒性，世界各國(guó)普遍禁止將硼砂添加于食品中，我國(guó)《食品衛(wèi)生法》和《食品添加劑衛(wèi)生管理辦法》中明令禁止將硼砂作為食品添加劑使用。

目前我國(guó)尚未出臺(tái)用于直接檢測(cè)食品中硼砂的標(biāo)準(zhǔn)方法，現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)—食品中硼酸的測(cè)定》(GB 5009.275-2016)是通過(guò)檢測(cè)硼砂的分解產(chǎn)物硼酸的含量從而間接計(jì)算出食品中硼砂的含量。現(xiàn)行市面上最為認(rèn)可的檢測(cè)方法是乙基己二醇-三氯甲烷萃取姜黃比色法。該法需要先在酸性條件下將硼砂轉(zhuǎn)變?yōu)榕鹚幔ㄟ^(guò)檢測(cè)硼酸的含量來(lái)間接推算出硼砂的添加量。由于樣品前處理環(huán)節(jié)中的酸化與多次過(guò)濾操作，令檢測(cè)液中的硼酸成分出現(xiàn)部分損失，從而使得該檢測(cè)方法的結(jié)果具有一定的偏差，且檢測(cè)結(jié)果只能表示食品中存有硼酸，并不一定是直接添加了硼砂。綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題是：檢測(cè)結(jié)果具有一定的誤差，且法實(shí)現(xiàn)食品中硼砂的直接檢測(cè)。因此為了保證廣大人民群眾的身體健康，填補(bǔ)市面上直接檢測(cè)硼砂方法的空缺，建立一種準(zhǔn)確可靠、靈敏快速、廣泛適用的直接檢測(cè)食品中硼砂的方法顯得尤為重要。

核酸適配體是經(jīng)過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SyStematic evolution ofligandS by exponential enrichment，SELEX)篩選得到的能與金屬離子、小分子、生物大分子，甚至整個(gè)細(xì)胞高特異性、高親和性結(jié)合的ssDNA或RNA分子。核酸適配體不僅具備抗體分子的識(shí)別特性，凡是涉及抗體的診斷領(lǐng)域，幾乎都可以用核酸適配體來(lái)代替，而且還具備自己獨(dú)特的優(yōu)異性能，其具有靶分子范圍廣、分子質(zhì)量小、免疫原性低、易于化學(xué)合成、改造和標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)核酸適配體在治療新藥、藥物運(yùn)輸、癌細(xì)胞檢測(cè)、生物成像、生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、毒品檢測(cè)、抗病毒等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。因此，可將核酸適配體技術(shù)運(yùn)用到食品檢測(cè)領(lǐng)域，可以實(shí)現(xiàn)食品中硼砂的直接檢測(cè)。且通過(guò)該技術(shù)建立的檢測(cè)方法無(wú)需較為繁瑣的樣品預(yù)處理步驟，能夠降低硼砂的損耗，使得檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體及利用SELEX篩選方法和應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體，所述與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。