[發(fā)明專利]與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體及利用SELEX篩選方法和應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910371702.3
• 申請日: 2019-05-06
• 公開（公告）號: CN110423754A
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發(fā)明（設計）人: 韓芹芹;靖樂;夏雪山;宋玉竹;張金陽;王炳輝
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/6806;G01N33/53
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體，其特征在于，所述與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體，其特征在于，所述與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，吉布斯自由能DG＝-11.90。

3.如權(quán)利要求1所述的與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體，其特征在于，所述與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體基于酶聯(lián)寡核苷酸吸附測定法ELONA，進行其特異性、親和力和靈敏度性質(zhì)評估。

4.一種如權(quán)利要求1所述與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體的篩選方法，其特征在于，所述與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體的篩選方法包括以下步驟：

第一步，硼砂特異性核酸適配體的篩選、克隆、分離和測序；

第二步，核酸適配體單鏈DNA二級結(jié)構(gòu)表征；

第三步，硼砂包被原的制備；

第四步，核酸適配體的特異性、親和力及對硼砂的靈敏性；

第五步，核酸適配體的截短實驗分析。

5.如權(quán)利要求4所述的與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體的篩選方法，其特征在于，所述第一步具體包括：采用SELEX技術(shù)篩選出能夠與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體群體，設計引物進行PCR擴增、克隆、分離和測序；利用酶聯(lián)寡核苷酸吸附實驗進行驗證，得到適配體Bor-B02；適配體的接頭引物序列為：Aptamer Fw：GACATATTCAGTCTGACAGC；反向互補序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC；Aptamer Rv:GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互補序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC；所獲陽性單克隆進行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體由82個核苷酸組成，其序列(5’端至3’端)為：

GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC。

6.如權(quán)利要求4所述的與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體的篩選方法，其特征在于，所述第二步具體包括：使用MFOLD軟件對與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體Bor-B02單鏈DNA分子進行二級結(jié)構(gòu)預測；二級結(jié)構(gòu)具有突出的環(huán)和莖，吉布斯自由能DG＝-11.90。

7.如權(quán)利要求4所述的與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體的篩選方法，其特征在于，所述第三步具體包括：通過化學法將硼砂分子與BSA偶聯(lián)從而獲得硼砂的包被原，通過紫外吸收光譜判斷包被原的制備情況，結(jié)果顯示硼砂與BSA成功偶聯(lián)；

所述第四步具體包括：根據(jù)核酸適配體Bor-B02的序列，用體外轉(zhuǎn)錄方法合成生物素標記的核酸適配體，建立酶聯(lián)寡核苷酸檢測方法，對核酸適配體的特異性、親和力及其對硼砂的靈敏性進行檢測。

8.如權(quán)利要求4所述的與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體的篩選方法，其特征在于，所述第五步具體包括：通過ELONA法對核酸適配體Bor-B02進行截短以確定最佳結(jié)合位點；基于核酸適配體Bor-B02預測的二級結(jié)構(gòu)，對適配體Bor-B02進行截短。

9.一種如權(quán)利要求1～3任意一項所述與硼砂特異性結(jié)合的核酸適配體在識別硼砂試劑盒中的應用。