[發明專利]一種含有不穩定結構域的CAR-T細胞及其制備方法和調節CAR-T細胞功能方法

在審

• 申請號: 201910371296.0
• 申請日: 2019-05-06
• 公開（公告）號: CN110079504A
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 張文;孫嬌;劉江;唐東起
• 申請（專利權）人: 山東大學第二醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/867
• 代理公司: 山東濟南齊魯科技專利事務所有限公司 37108
• 代理人: 張娟

一種含有不穩定結構域的CAR?T細胞及其制備方法和調節CAR?T細胞功能方法，在CAR?T細胞中含有不穩定結構域的編碼基因，并且去除終止密碼子的CAR基因的3’端與不穩定結構域的編碼基因直接連接，構成融合基因；在CAR?T細胞中表達上述融合基因編碼的融合蛋白，該融合蛋白N端為CAR分子，C端為不穩定結構域，定位于細胞膜。本發明的含有不穩定結構域的CAR?T細胞的制備方法，流程少，步驟易于操作，便于實現產業化；本發明公開的調節含有不穩定結構域的CAR?T細胞功能的方法，只需加入不穩定結構域對應的小分子化合物即可調節CAR分子的數量，并且不穩定結構域的存在，不會影響CAR分子自身的功能。

技術領域

本發明涉及免疫學和細胞生物學技術領域，具體說是含有不穩定結構域的CAR-T細胞及其制備方法和調節CAR-T細胞功能方法。

背景技術

在細胞免疫治療領域，CAR-T療法已成為研究熱點，其主要原理為經嵌合抗原受體修飾的T細胞，可以特異性的識別腫瘤相關抗原，使效應性T細胞的靶向性、殺傷活性和持久性均高于常規應用的免疫細胞，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環境并打破宿主免疫耐受狀態。目前，隨著研究的深入，人們越來越考慮CAR-T應用中的安全性問題，即如何精確控制CAR-T細胞引起的抗原活動(如細胞因子風暴等)，并減少其他可能引起的副作用，對CAR-T細胞的活性實現精細控制等。

化學誘導的二聚體化技術CID即當加入小分子藥物rimiducid時，會引起分開的兩個單體結合，當每個單體上連接的激活或抑制原件靠近形成二聚體時，會起激活或抑制作用，最終實現用藥物控制活性開關。CID技術結合CAR-T技術，即開發了自殺開關CIDeCAR和活性開關GoCAR-T，以提供比現有細胞免疫療法更安全有效的方法。其中，自殺開關CIDeCAR技術是將引起細胞凋亡的自殺蛋白Caspase9連接到藥物結合結構域單體上，當口服化學藥物后，引起Caspase9二聚體化，從而被激活啟動細胞凋亡程序，進而引發CAR-T細胞凋亡，從體內清除CAR-T，中止反應。而活性開關GoCAR-T技術是將CAR的共激活信號連接到藥物結合結構域單體上，若不口服化學藥物后，僅靠腫瘤細胞的接觸不能啟動CAR-T細胞，通過口服化學藥物，可提供共激活信號，啟動和激活CAR-T反應。

近年來發展出來一種依賴于細胞內分解機器的蛋白調控系統，利用細胞膜可透過的小分子化合物配體和特定結構域來實現對感興趣蛋白的調節，所謂的特定結構域，指蛋白相應的結構域編碼基因經過突變后，在小分子化合物配體不存在的情況下，該結構域變的不穩定，易被細胞內蛋白酶體降解，而結合小分子配體后，該結構域趨于穩定，這樣的結構域稱為不穩定結構域(Destabilizing domains；DD)。目前不穩定結構域一般和免疫調節因子連接，這些因子可能增強過繼細胞療法的功效，但需要精確控制以優化其治療效果，目前的技術無法精確調控細胞發揮治療作用的時間或細胞因子的表達水平，這使許多潛在的應用難以安全有效地部署，缺乏可調性也使得瞬時表達的強效蛋白難以安全表達。

發明內容

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種含有不穩定結構域的CAR-T細胞及其制備方法和調節CAR-T細胞功能方法。

本發明為實現上述目的，通過以下技術方案實現：

一種含有不穩定結構域的CAR-T細胞，在CAR-T細胞中含有不穩定結構域的編碼基因，并且去除終止密碼子的CAR基因的3’端與不穩定結構域的編碼基因直接連接，構成融合基因；在CAR-T細胞中表達上述融合基因編碼的融合蛋白，該融合蛋白N端為CAR分子，C端為不穩定結構域，定位于細胞膜。

在CAR-T細胞中，由于不穩定結構域的特性，上述表達的融合蛋白易被蛋白酶體降解，導致細胞膜上CAR分子不能積累；當不穩定結構域對應的小分子化合物配體存在于CAR-T細胞中時，上述融合蛋白不被蛋白酶體降解，細胞膜上CAR分子得到積累。融合蛋白中不穩定結構域的存在，不會影響CAR分子自身的功能。