[發明專利]一種具有增強免疫活性的青蛤多糖及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201910369722.7
• 申請日: 2019-05-06
• 公開（公告）號: CN110128560B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 宋爽;曹春陽;宮悅;閆春紅;艾春青;溫成榮;付穎寰;董秀萍;祁立波
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61K31/715;A61P37/04;A23L33/125
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

1.一種具有增強免疫活性的青蛤多糖，其特征在于，所述青蛤多糖的主鏈由→4)-α-D-Glcp(1→構成，所述青蛤多糖結構中→4)Glc(1→和→4,6)Glc(1→的比例為6.8:1，分子量為380KDa，多糖的單糖組成為甘露糖:葡萄糖＝1:35。

2.一種如權利要求1所述具有增強免疫活性的青蛤多糖的制備方法，其特征在于，包括步驟：

S1、制備脫脂粉：取青蛤肉凍干后破碎成青蛤粉，使用丙酮對所述青蛤粉進行脫脂，干燥得脫脂粉；

S2、酶解：取步驟S1所述脫脂粉，每克脫脂粉中加入2～5mL 0.05mol/L的半胱氨酸-EDTA二鈉溶液和15～25mL 0.05mol/L、pH＝8的K₂HPO₄緩沖液，再加入胰蛋白酶，37℃、100～150rpm振蕩酶解2～5h，得混合溶液1；向所述混合液1中加入木瓜蛋白酶，65℃、100～150rpm振蕩酶解1～5h得混合液2；

其中，所述胰蛋白酶的添加量為每克脫脂粉加入1250～7500U的胰蛋白酶；所述木瓜蛋白酶的添加量為每克脫脂粉加入10000～60000U的木瓜蛋白酶；

S3、滅酶：將步驟S2所述混合液2加熱，使酶失活，冷卻到室溫，離心取上清液；

S4、絡合沉淀：向步驟S3所述上清液中加入質量百分濃度0.1％～15％的氯化十六烷基吡啶溶液，室溫放置2～48h，離心取沉淀1；

其中，所述質量百分濃度0.1～15％氯化十六烷基吡啶溶液的添加量為：以步驟S2所述脫脂粉的添加量為參照，每克脫脂粉對應添加1～2mL質量百分濃度0.1～15％氯化十六烷基吡啶溶液；

S5、醇沉：取步驟S4所述沉淀1，每克沉淀1溶解于10～20mL NaCl-乙醇混合溶液，再加入25～35mL體積分數70％～100％乙醇溶液，4℃放置2h以上，離心取沉淀2；

其中，所述NaCl-乙醇混合溶液為1～5mol/L NaCl溶液和體積分數70％～100％乙醇以體積比100:15混合所得溶液；

S6、除雜質：將步驟S5所述沉淀2用乙醇洗滌，然后經過透析除鹽，得粗糖溶液；

S7、凍干：取步驟S6所述粗糖溶液凍干得到青蛤粗糖；

S8、純化：將步驟S7所述青蛤粗糖溶解于去離子水，使用DEAE-纖維素柱純化，依次用去離子水、0.01M NaCl、0.02M NaCl和0.05M NaCl溶液各洗脫2～5個柱體積，收集0.05M NaCl溶液洗脫部分，經透析后凍干，得到青蛤多糖。

3.根據權利要求2所述具有增強免疫活性的青蛤多糖的制備方法，其特征在于步驟S1所述制備脫脂粉具體為：取青蛤肉凍干，所述凍干條件為：凍干機冷阱溫度-60℃，真空度1～10Pa，所述青蛤肉凍干時間≥4h；將凍干后的青蛤破碎成青蛤粉，按料液比3:10g/ml向所述青蛤粉中加入丙酮，100～500rpm攪拌0.5～2h，靜置2～24h，去除上層丙酮，所得沉淀干燥至質量恒定，得脫脂粉。

4.根據權利要求2所述具有增強免疫活性的青蛤多糖的制備方法，其特征在于，步驟S3所述滅酶具體為：將所述混合液2置于100℃加熱2～10min，4～30℃、3000～10000r/min離心5～60min，取上清液。

5.根據權利要求2所述具有增強免疫活性的青蛤多糖的制備方法，其特征在于，步驟S4所述離心具體為：4～30℃、3000～10000r/min離心5～60min。

6.根據權利要求2所述具有增強免疫活性的青蛤多糖的制備方法，其特征在于，步驟S5所述離心為：3000～15000r/min離心5～60min。