[發(fā)明專利]一種外囊泡的表征方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910368813.9
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110068529B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊慧;杜靜
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種外囊泡的表征方法，其特征在于，所述方法采用蛋白質(zhì)熒光染料和細(xì)胞膜熒光染料進行雙重?zé)晒馊旧ㄟ^流式細(xì)胞儀獲取外囊泡的多參數(shù)，實現(xiàn)評估表征；

所述蛋白質(zhì)熒光染料包括羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯CFSE；

所述細(xì)胞膜熒光染料包括親脂性羰花青染料Dil或/和十八烷基羅丹明B氯鹽；

所述羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯CFSE的工作濃度為10-80nM；

所述親脂性羰花青染料Dil的工作濃度為0.5-2nM。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述外囊泡包括外泌體或/和微囊泡。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述細(xì)胞膜熒光染料為親脂性羰花青染料Dil。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)分離提取外囊泡；

(2)將羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯CFSE與外囊泡混合后避光孵育染色；

(3)將步驟(2)孵育染色后的產(chǎn)物加入親脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色；

(4)將步驟(3)孵育染色后的產(chǎn)物稀釋后進行流式細(xì)胞儀檢測，收集數(shù)據(jù)并分析。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述孵育的溫度為35℃-37℃；

步驟(2)所述孵育的時間為0.2-3h。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述孵育的條件為23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述孵育的條件為23℃-26℃孵育10-30min。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述稀釋的倍數(shù)為10-1000倍。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

(1)分離提取外囊泡；

(2)將工作濃度為10-80nM的羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯CFSE與外囊泡混合后避光35℃-37℃孵育0.2-3h染色；

(3)將步驟(2)孵育染色后的產(chǎn)物加入工作濃度為0.5-2nM的親脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色，23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min；

(4)將步驟(3)孵育染色后的產(chǎn)物稀釋10-1000倍后進行流式細(xì)胞儀檢測，收集數(shù)據(jù)并分析。

10.一種包括羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯CFSE和親脂性羰花青染料Dil的組合物用于外囊泡的雙重?zé)晒馊旧膽?yīng)用；

所述羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯CFSE的工作濃度為10-80nM；

所述親脂性羰花青染料Dil的工作濃度為0.5-2nM。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述外囊泡為外泌體或/和微囊泡。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括評估外囊泡的有效濃度、外囊泡樣品完整性和生物活性、細(xì)胞外囊泡的粒徑范圍或樣品中雜質(zhì)含量中的任意一種或至少兩種的組合；

所述雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)聚合物和脂類化合物。

13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括表征生物樣品中外泌體或/和微囊泡結(jié)構(gòu)的完整率或/和破損率。