[發明專利]一種外囊泡的表征方法

有效

• 申請號: 201910368813.9
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110068529B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 楊慧;杜靜
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種外囊泡的表征方法，所述方法采用蛋白質熒光染料和細胞膜熒光染料進行雙重熒光染色，通過流式細胞儀獲取外囊泡的多參數，實現評估表征；本發明通過將蛋白質熒光染料和細胞膜熒光染料相結合，優化實驗步驟和條件，應用于流式細胞儀檢測生物樣品中外囊泡，拓寬了熒光染料的新用途，基于蛋白質熒光染料和細胞膜熒光染料的雙重染色在評估外囊泡中具有較好的效果。

技術領域

本發明涉及生物化學領域，主要涉及一種外囊泡的表征方法，尤其涉及一種微囊泡或/和外泌體的表征方法。

背景技術

細胞外囊泡(extracellular?vesicle，EVs)是指細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑從30nm到1000nm不等。細胞外囊泡主要由微囊泡(microvesicle)和外泌體(exosome)組成。微囊泡是細胞激活、損傷或凋亡后從細胞膜脫落的小囊泡，直徑約為100nm–1000nm。外泌體由細胞內的多泡小體(Multivesicular?bodies)與細胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細胞外，直徑約為30nm-100nm。幾乎所有類型的細胞，包括癌細胞都會釋放外泌體。作為細胞間通訊的重要介質，外泌體介導了蛋白質和遺傳物質的轉運和交換。

目前細胞外囊泡(EVs)的檢測方法主要有掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、動態光散射技術(DLS)、納米微粒追蹤分析術(NTA)、流式細胞儀和酶聯免疫分析(ELISA)等，由于動態光散射技術和納米微粒追蹤分析術僅能表征生物樣品的物理參數；而掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡的樣品前處理步驟復雜且對操作人員的經驗要求較高；由于通量高、用時短、操作簡單，酶聯免疫分析和流式細胞儀已成為目前較常用的方法。酶聯免疫分析方法容易受其他可溶性抗原的干擾，而且無法知道囊泡的大小、數量等信息；流式細胞儀可以檢測囊泡的大小、數量，因理論上是進行囊泡快速、高通量、多參數檢測的最優選擇。但納米流式儀造價高昂，不利于在醫院和疾病檢測中心的應用和推廣；到目前為止以上技術也未在醫療領域中得到廣泛應用。

因此，研發一種簡潔高效、適用于常規流式細胞儀，用于表征評估外泌體或/和微囊泡的檢測方法，具有廣闊的應用前景和巨大的市場價值。

發明內容

針對現有技術的不足和市場的需求，本發明提供了一種外囊泡的表征方法，通過將蛋白質熒光染料和細胞膜熒光染料相結合，應用于流式細胞儀檢測生物樣品中外泌體或/和微囊泡，拓寬了熒光染料的新用途，在評估外囊泡中具有較好的效果。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

第一方面，本發明提供一種外囊泡的表征方法，所述方法采用蛋白質熒光染料和細胞膜熒光染料進行雙重熒光染色，通過流式細胞儀檢測并獲取外囊泡的多參數，實現生物樣品的評估表征。

現有技術中，鑒定微囊泡和外泌體的方法是納米流式和掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、動態光散射技術、納米微粒追蹤分析術、流式細胞儀和酶聯免疫分析，但納米微粒追蹤分析術和酶聯免疫分析的方法只能表征樣品的物理參數；而掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡雖然可以表征樣品的生物結構，對樣品和操作人員的要求較高；納米流式儀是針對于外囊泡而專門研發的流式儀，目前儀器購置成本高；以上因素均嚴重限制了外囊泡表征方法的發展與推廣。本方法采用胞內通用型酯酶的蛋白質熒光染料和通用型細胞膜熒光染料的雙重染色，通過流式細胞儀來獲取微囊泡和外泌體的多參數，用以其特征的評估。

優選地，所述外囊泡包括外泌體或/和微囊泡。