[發明專利]一種沙蠶激酶的提取方法

有效

• 申請號: 201910367848.0
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110093335B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 石清東;王正元
• 申請（專利權）人: 北京顥美細胞基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;A61K38/48;A61K9/20
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明涉及一種沙蠶激酶的提取方法，包括沙蠶預處理，添加緩沖液勻漿，擠壓過濾，酶解及沙蠶激酶活化，高溫除雜，混合分級鹽析，先用低濃度的混合鹽溶液進行鹽析去除雜質，再用高濃度的混合鹽溶液進行鹽析收集富含目標蛋白的沉淀物；將所得沉淀物進行疏水層析和離子層析，超濾濃縮，冷凍干燥，獲得高效價纖溶酶。本發明方法可提高進沙蠶組織中沙蠶激酶的鹽析溶出程度及沙蠶激酶活化程度，提升了提取產率及產品效價。本發明方法提取率高，適用于工業化生產。

技術領域

本發明涉及一種沙蠶激酶的制備方法，屬于生物制藥領域。

背景技術

疣吻沙蠶(俗稱禾蟲，Tylorrhynehush eterochaetus)，在系統分類上屬于無脊椎動物中的環節動物門(Annelida)，多毛綱(Polychaeta)，游走目(Errantia),沙蠶科(Nereidae)，疣吻沙蠶屬(Tylorrhynchus)，是一廣泛分布于暖溫帶和亞熱帶沿海的種，在印度尼西亞、越南、日本及我國南京、上海、福建、廣東和廣西等都有分布。

全球心腦血管治療市場仍將保持快速發展的勢頭，并在全球醫藥市場上繼續占據重要的地位。心腦血管治療市場的規模及其重要性已經使其成為許多制藥公司的一個重要目標，而心血管疾病患者的人數增加正在推動這一市場的發展。心腦血管藥在全球范圍內是第一大類藥，約占藥品總規模的20％。無論國內外，心腦血管治療市場都非常巨大.所以，開發從沙蠶中獲得的纖溶酶其溶栓活性不低于蚓激酶活性，它既有直接降解纖維蛋白的作用，又能激活纖溶酶原，間接降解纖維蛋白。與尿激酶相比，沙蠶溶纖酶具有較好的熱穩定性，尿激酶在37℃很快失活，故尿激酶不適宜制成口服制劑，只能靜脈注射。而沙蠶溶纖酶則可以研制成適宜口服的新型溶栓藥物或保健食品，其熱穩定性較蚓激酶相對較高。

中國專利CN1234443A公開了一種沙蠶激酶及其提取方法和用途的專利，其在沙蠶中提取沙蠶激酶分子量在25000～55000之間，等電點在3～7之間，但其沙蠶激酶提取率較低，500g沙蠶僅獲得約4000～5000U沙蠶激酶。博士論文《一種新型日本刺沙蠶纖溶酶的分離、特性及質量標準》中探索了沙蠶激酶的提取方法，其采用硫酸銨鹽析、PhenylSepharose 6FF疏水層析、DEAE Sepharose FF陰離子離子交換層析和Sephacryl S-100HR凝膠過濾層析，獲得日本刺沙蠶纖溶酶。該提取方法雖與本發明所采用的沙蠶種類不同，但該方法對沙蠶激酶的提取方法進行了初步探索，對提取方法進行放大處理時，其仍存在，初提取液黏度大，鹽析過程中沉淀雜質含量較高及鹽用量大，提取產率及效價低的問題。

發明內容

為克服現有沙蠶激酶提取過程中沙蠶激酶初提液黏度大，沙蠶激酶鹽析得率低及雜質含量高、產品效價低的問題，本發明對現有提取方法進行改進，提供了一種從沙蠶中提取沙蠶激酶的方法，該方法可提高沙蠶組織中沙蠶激酶的鹽析析出程度及沙蠶激酶活化程度，提升了提取產率及產品效價。本發明方法提取率高，適用于工業化生產。

本發明技術方案如下：

一種沙蠶激酶的提取方法，包括如下步驟：

將沙蠶添加預冷的磷酸鹽緩沖液后勻漿，擠壓過濾，收集濾液；

向所得濾液中加入堿性脂肪酶，保溫酶解并使沙蠶激酶活化，制得酶解液；

通常可在酶解后降至常溫，過濾得濾液或離心收集上清液，得酶解液；

將所得酶解液于55～60℃高溫除雜后，將濾液或離心所得上清液用0.5μm微孔濾膜過濾，收集膜過濾液；

將所得膜過濾液分級鹽析，即先用低濃度的混合鹽溶液進行鹽析去除雜質，再用高濃度的混合鹽溶液進行鹽析，離心收集沉淀物；

將所得沉淀物依次疏水層析、凝膠過濾除鹽層析、離子交換層析，超濾濃縮，冷凍干燥，制得沙蠶激酶。

本發明方法提取所得沙蠶激酶為高效價纖溶酶。