[發明專利]一種沙蠶激酶的提取方法

有效

• 申請號: 201910367848.0
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110093335B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 石清東;王正元
• 申請（專利權）人: 北京顥美細胞基因生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;A61K38/48;A61K9/20
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

1.一種沙蠶激酶的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

將沙蠶添加預冷的磷酸鹽緩沖液后勻漿，擠壓過濾，收集濾液；

向所得濾液中加入堿性脂肪酶，保溫酶解并使沙蠶激酶活化，制得酶解液；

酶解后降至常溫，過濾得濾液或離心收集上清液，得酶解液；

將所得酶解液于55～60℃高溫除雜后，將濾液或離心所得上清液用0.5μm微孔濾膜過濾，收集膜過濾液；

將所得膜過濾液分級鹽析，即先用低濃度的混合鹽溶液進行鹽析去除雜質，再用高濃度的混合鹽溶液進行鹽析，離心收集沉淀物；

所述用低濃度的混合鹽溶液進行鹽析去除雜質，其條件為調至鹽析溶液中(NH₄)₂SO₄濃度為2.5～3.0g/L，NaCl濃度為7.0～8.0g/L，在溫度6～10℃條件下進行攪拌和鹽析去除雜質；所述用高濃度的混合鹽溶液進行鹽析，其條件為調至鹽析溶液中(NH₄)₂SO₄ 濃度為7.0～8.0g/L，NaCl濃度為17.0～19.0g/L，在溫度6～10℃條件下進行攪拌和鹽析，收集沉淀，獲得粗制品；

將所得沉淀物依次疏水層析、凝膠過濾除鹽層析、離子交換層析，超濾濃縮，冷凍干燥，制得沙蠶激酶；所述沙蠶激酶比活力為5.4～5.9萬IU/mg；

所述酶解的條件：采用堿性脂肪酶，酶添加量為沙蠶重量的0.05～0.2％，最適酶解pH為7.0～9.0，酶解溫度為30～35℃，酶解時間為2.0～3.0h。

2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿采用預冷到8～10℃的pH7.5～8.5，0.14～0.18mM磷酸鹽緩沖液。

3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿時間為10～20s；所述磷酸鹽緩沖液與沙蠶的比例為2～2.5L/kg。

4.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液與沙蠶的比例為2～2.5L/kg。

5.根據權利要求1、3、4任一項所述的提取方法，其特征在于，所述疏水層析選用的介質為Butyl Sepharose FF。

6.根據權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述疏水層析所用平衡緩沖液為含有1.0M/L(NH₄)₂SO₄的pH7.4 15mM磷酸鹽緩沖液；洗脫緩沖液為pH7.4 15mM磷酸鹽緩沖液。

7.根據權利要求1、3、4任一項所述的提取方法，其特征在于，所述凝膠過濾除鹽層析選用的介質為Sephadex G-25M。

8.根據權利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述凝膠過濾除鹽所用平衡緩沖液和洗脫緩沖液均為pH7.4 20mM Tris-HCl buffer。

9.根據權利要求1、3、4任一項所述的提取方法，其特征在于，所述離子交換層析所用介質為DEAE Sepharose FF。

10.根據權利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述離子交換層析所用平衡緩沖液為pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脫緩沖液為含1.0M/L NaCl的pH7.4 20mM Tris-HClbuffer。

11.根據權利要求1、3、4任一項所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取鮮活的疣吻沙蠶(Tylorrhynchus heterochaetus)，饑餓飼養處理后臭氧消毒；

2)將消毒后的沙蠶放入預冷到8～10℃的pH7.5～8.5，0.14～0.16mM磷酸鹽緩沖液中，勻漿，擠壓過濾，收集濾液；沙蠶與所述磷酸鹽緩沖液的比例為10kg/(20～25)L；

3)向所得濾液中加入堿性脂肪酶，于pH7.0～9.0、溫度30～35℃條件下，保溫酶解2.0～3.0h；酶解后置于4℃條件下離心，收集上清液；堿性脂肪酶添加量為沙蠶重量的0.1％～0.2％；

4)將所得酶解液升溫至55～60℃，維持30～50min；然后迅速在冰水中冷卻至室溫，4℃條件下離心，收集上清液，去除沉淀；將上清液用0.5μm的微孔濾膜過濾，收集膜過濾液；

5)向所得膜過濾液中加入(NH₄)₂SO₄和NaCl，使硫酸銨濃度為2.5～3.0g/L，氯化鈉濃度為7.0～8.0g/L，在冰浴中持續攪拌20min，然后置于4℃條件下，靜置鹽析4h；離心去除沉淀，收集上清液；

向所得上清液中繼續加入(NH₄)₂SO₄和NaCl，使硫酸銨濃度為7.0～8.0g/L，氯化鈉濃度為17.0～19.0g/L；在冰浴中持續攪拌20min，然后置于4℃條件下，靜置鹽析4h；離心，棄去上清液，收集沉淀，將沉淀真空冷凍干燥，備用；

6)疏水層析：采用Butyl Sepharose FF作為疏水介質，平衡緩沖液為含有1.0M/L(NH₄)₂SO₄的pH7.4，15mM磷酸鹽緩沖液；洗脫緩沖液為pH7.4，15mM磷酸鹽緩沖液；

7)凝膠過濾除鹽層析：采用Sephadex G-25M作為介質對步驟6)分離所得組分進行除鹽層析；平衡緩沖液和洗脫緩沖液均為pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；

8)離子交換層析：采用DEAE Sepharose FF凝膠材料為介質進行子交換層析，平衡緩沖液為pH7.4，20mM Tris-HCl buffer；洗脫緩沖液為含1.0M/L NaCl的pH7.4，20mM/L Tris-HCl buffer；

9)超濾濃縮及冷凍干燥：取纖溶酶活性較高的活性組分進行超濾除鹽脫水，脫去小分子物質，直至溶液電導率≤0.2×10³μs/cm；并將澄清液真空冷凍干燥，得到沙蠶激酶凍干粉。