[發明專利]源自Nocardia farcinica的L-泛解酸內酯脫氫酶及其應用

有效

• 申請號: 201910366852.5
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110527671B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 應向賢;汪釗;趙嫚;程先鋒;林行;殷杭華;張連春;毛王偉;陳梁;白彥兵;金文究;沈漢軍;汪軍;蔡劍敏
• 申請（專利權）人: 杭州鑫富科技有限公司;浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎;趙青朵

本發明涉及基因工程技術領域，更具體地說，涉及L?泛解酸內酯脫氫酶及其應用。本發明首次揭示了來源于Nocardia farcinica的L?泛解酸內酯脫氫酶，其對L?泛解酸內酯具有良好的酶活性，可以應用于D?泛解酸內酯的催化合成中。本發明構建了多酶級聯催化L?泛解酸內酯手性翻轉合成D?泛解酸內酯的體系，以共表達L?泛解酸內酯脫氫酶、D?酮基泛解酸內酯還原酶和葡萄糖脫氫酶的基因工程菌細胞為催化劑，避免了中間產物酮基泛解酸內酯的積累與自發水解，省去了中間產物的分離、L?泛解酸內酯的消旋以及D?泛解酸在酸性條件下內酯化等步驟，簡化了反應過程，減少了酸堿的使用，提高了反應效率。

技術領域

本發明涉及微生物基因工程技術領域，更具體地說，涉及源自Nocardiafarcinica的L-泛解酸內酯脫氫酶、其編碼基因、載體、重組細胞及其應用。

背景技術

D-泛酸鈣又稱維生素B5，是輔酶A的組成部分，已經廣泛應用于醫藥、食品、飼料和化妝品等行業。D-泛解酸內酯是合成D-泛酸鈣的重要原料，在工業化生產上先通過化學法合成DL-泛解酸內酯，再利用內酯水解酶選擇性水解混旋泛解酸內酯中的D-泛解酸內酯生成D-泛解酸，接著分離D-泛解酸和L-泛解酸內酯，分離后的D-泛解酸經酸化成環形成D-泛解酸內酯，而L-泛解酸內酯經消旋化后回用。因此，水解酶催化的手性拆分法盡管工藝成熟，但仍然存在步驟較長、酸堿耗用高等問題。鑒于此，開發更為直接、高效、環保的D-泛解酸內酯不對稱合成方法替代現有的手性拆分技術將具有重要的應用價值。D-泛解酸內酯可通過氧化還原法不對稱合成，該方法包括兩種途徑，第一種是以混旋的DL-泛解酸內酯為底物，利用立體選擇性專一的L-泛解酸內酯脫氫酶催化L-泛解酸內酯脫氫生成酮基泛解酸內酯，接著酮基泛解酸內酯在D-酮基泛解酸內酯還原酶催化下不對稱生成D-泛解酸內酯；第二種途徑也是先以L-泛解酸內酯脫氫酶催化L-泛解酸內酯脫氫生成酮基泛解酸內酯，接著酮基泛解酸內酯自發水解形成酮基泛解酸，然后在D-酮基泛解酸還原酶的作用下生成D-泛解酸，接著D-泛解酸在酸的作用下閉環形成D-泛解酸內酯。該過程以第一條通路更為簡捷，與現有的水解酶催化通路相比，工藝更為簡單，混旋的底物經生物催化直接得到光學純產物，不需要消旋步驟，也不需要內酯和酸的分離步驟；在基因工程菌內構建輔酶循環系統，可不需要外加輔酶；以基因工程菌作為整細胞催化劑不需要酶的分離純化步驟。因此，氧化還原酶不對稱合成D-泛解酸內酯的方法是一種非常有前景的生物水解酶法替代者。