[發明專利]一種PS轉座子系統及其介導的基因轉移方法

有效

• 申請號: 201910366530.0
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110257425B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 宋成義;王賽賽;高波;宗文成;沈丹;王亞麗;產舒恒;桑亞通
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 薛海霞;董建林

本發明公開一種PS轉座子系統及其介導的基因轉移方法，包括可插入目的基因盒的兩個末端重復序列的轉基因供體質粒和提供轉座活性的轉座酶輔助質粒。通過PS轉座子系統將目的基因導入受體基因組。本發明提供的基于PS轉座子系統的基因轉移方法，經過細胞和胚胎水平驗證能夠高效介導基因轉移，可應用于多個生物技術領域：1）使用本發明中給出的方法可有效地將目的基因盒插入到宿主基因組中，提高基因轉移效率；2）與基因捕獲技術結合可以有效開展動物基因功能研究；3）可以介導進行人類基因治療等。

技術領域

本發明涉及建立一種PS轉座子系統介導的基因轉移方法，同時還公開了該方法涉及的轉基因供體質粒和轉座酶真核表達及體外轉錄輔助質粒的構建方法，及其在制備轉基因動物、研究基因功能和人類基因治療中的應用。本發明屬于動物基因工程領域。

背景技術

基因轉移是當前一項重要的生物技術手段，可以介導外源基因穩定的整合到宿主染色體中，所以在研究基因功能、制備轉基因生物和人類基因治療等領域中都有重要的應用價值。

轉座子是基因組上一段可以自由跳躍的DNA序列，首先是由Mc.Clintock于20世紀40年代在玉米染色體中發現，后又陸續在細菌、真菌及昆蟲等各種生物中發現。經過對轉座子的注解之后發現無論在原核生物還是真核生物中都存在相當數量的轉座子。轉座子在不同生物間分布存在較大差異，尤其是高等真核生物中含量更高，例如轉座子是哺乳動物基因組中最大的組分，幾乎占到人類基因組的一半，在玉米中幾乎占到80％。DNA轉座子的轉座過程遵循“剪切-粘貼”的機制在基因組上進行移動，因此被作為有效的基因轉移工具進行開發。近年來，轉座子在人類基因治療，轉基因鼠和斑馬魚等模式生物制備和功能基因組學的研究上已經取得了重要的進展。除此之外，轉座子作為基因轉移的載體具有很多優勢：1)結構簡單，與外源基因共同整合入受體基因組的只是兩側的TIR序列，對外源基因的影響很小，在整合位點也沒有發現大片段的丟失和染色體重排的現象；2)相較與病毒載體，DNA轉座子載體對插入片段限制較小；3)外源基因可以穩定整合到染色體中，而且通過生殖細胞傳代后也能夠長期的表達；4)轉座酶可以催化單拷貝的基因精確的插入手提序列中，不再依靠隨機整合且插入片段的大小也不會發生變化；5)轉座子系統可以全部以裸露的DNA形式給予，也可以DNA與RNA或者蛋白質的形式提供轉座酶相結合進行轉座，所以其免疫原性較低。其中研究最為廣泛的DNA轉座子Sleeping Beauty(SB)、PiggBac(PB)和Tol2，這三種轉座子不僅發生起源不同，在轉座活性、插入偏好性方面也存在差異，因此在應用上也有所區別。例如SB偏好插入位點是“TA”，但是對基因沒有偏好性，所以SB轉座子常被用于人類基因治療；PB偏好插入位點是“TTAA”，而且偏好插入基因內部，所以常被用于功能基因研究、基因捕獲等；Tol2則沒有很明顯的偏好插入位點，插入位置多為基因上游調控區，故常用來研究增強子捕獲等。

顯微注射已經被廣泛應用，且技術成熟穩定，同時科學家們利用轉座子介導基因轉移的特點，進一步完善了轉座子介導細胞質顯微注射的方法。由于DNA轉座系統中的轉座酶含有核定位信號序列(NLS)，可以順利的介導目的基因進入細胞核，注射可以不入核，直接進行細胞質注射。所以這項技術正受到重視，并取得了令人鼓舞的進展，這可能是突破大型哺乳動物轉基因技術瓶頸的新方法。

轉座子用于人類基因治療主要包括目的基因克隆、基因轉移、靶細胞選擇和臨床試驗觀察等階段，其中基因轉移則是基因治療的關鍵步驟，而DNA轉座子介導的基因轉移在基因治療中的優點就是高效、安全。迄今為止，轉座子已經稱為基因治療中最常用的非病毒載體。此外，轉座子還可以制備突變體，開展基因捕獲，應用與功能基因組學研究。