[發明專利]利用二乙酰胺四乙酸鈉對骨骼或牙齒進行DNA提取的方法

在審

• 申請號: 201910363956.0
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110004143A
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發明（設計）人: 張丹;李志業;伊鵬;郭科建;宣樹卿;康成良;林改革
• 申請（專利權）人: 山東森芃生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙) 11390
• 代理人: 胡劍輝

本發明公開了一種利用二乙酰胺四乙酸鈉對骨骼或牙齒進行DNA提取的方法，利用裂解液中的二乙酰胺四乙酸鈉成分對骨骼或牙齒中的鈣質成分的螯合作用，對骨骼或牙齒進行脫鈣，然后利用裂解液中的表面活性劑及蛋白酶K成分對骨骼或牙齒中的細胞膜及蛋白質進行裂解消化，釋放DNA成分，最后經過一系列的分離、漂洗、洗脫步驟，提取得到DNA；裂解液中的乙二酰胺四乙酸鈉成分對骨骼或牙齒中的鈣成分具有更強的螯合作用，能更加高效快速地對骨骼或牙齒進行脫鈣，提高了DNA提取得率的同時還縮短了提取時間。

技術領域

本發明屬于DNA提取技術領域，具體涉及一種利用二乙酰胺四乙酸鈉對骨骼或牙齒進行DNA提取的方法。

背景技術

在骨骼、牙齒等生物樣本中，含有大量的金屬鈣元素成分，由于大量鈣化合物的存在，使得DNA提取過程中，溶液很難進入到骨頭、牙齒內部，從而阻止了對骨頭、牙齒內部細胞的裂解消化。同時也是由于鈣化合物的存在，使得其內部的細胞或DNA更能耐受微生物的分解，因此，在法醫DNA領域或古生物領域，骨骼或牙齒經常成為唯一有可能用于DNA提取的樣本。

金屬螯合劑(metal chelating agent)可以通過螯合劑分子與金屬離子的強結合作用，將金屬離子包合到螯合劑內部，變成穩定的，分子量更大的化合物，從而阻止金屬離子起作用。金屬螯合劑種類繁多，作用能力各有差異，現有技術中，金屬螯合劑EDTA在骨骼、牙齒等生物樣本的DNA提取中被廣泛使用，本發明提供一種利用二乙酰胺四乙酸鈉對骨骼或牙齒進行DNA提取的方法，該發明方法使用了螯合能力更強的金屬螯合劑乙二酰胺四乙酸鈉。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種利用二乙酰胺四乙酸鈉對骨骼或牙齒進行DNA提取的方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

利用二乙酰胺四乙酸鈉對骨骼或牙齒進行DNA提取的方法，包含以下操作步驟：

(1)將300mg骨骼粉末或牙齒粉末放入離心管中，往其中加入500ul裂解液，于50-60℃條件下加熱裂解1-12小時；

(2)將步驟(1)中的離心管置于離心機中，以12000轉每分鐘的速度離心1-5分鐘，將上清液轉移至新的離心管中，加入750ul結合液并混合均勻；

(3)將步驟(2)新的離心管中的混合液轉移至離心柱中，將離心柱置于離心機中，以12000轉每分鐘的速度離心0.5-2分鐘；

(4)倒棄步驟(3)離心柱收集管中的液體，將離心柱放回離心柱收集管內，往離心柱中加入700ul漂洗液，于離心機中12000轉每分離心0.5-2分鐘；

(5)倒棄步驟(4)離心柱收集管中的液體，將離心柱放回離心柱收集管內，于離心機中12000轉每分離心2-5分鐘；

(6)將步驟(5)離心柱放入新的離心管內，往離心柱底部的硅膠膜中加入10-200ul洗脫液，靜置3-10分鐘，于離心機中以12000轉每分鐘的速度離心0.5-2分鐘，丟棄離心柱，離心管內液體即為DNA溶液。

進一步，步驟(1)所述裂解液包含:10-500mmol/l二乙酰胺四乙酸鈉、0.1-2％(w/v)十二烷基硫酸鈉、0.1-5mg/l蛋白酶K、0-0.1mol/l二硫蘇糖醇、5-100mmol/l三羥甲基氨基甲烷,pH值7.0-8.5。

進一步，步驟(2)所述結合液包含：40％-60％(w/v)異硫氰酸胍、8-18％(w/v)曲拉通X-100、50-200mmol/l檸檬酸鈉，pH值5.0-6.0。

進一步，步驟(3)所述離心柱為分子生物學實驗中常用耗材，其底部裝配有硅膠膜。

進一步，步驟(4)所述漂洗液為70-85％(v/v)乙醇。