[發明專利]一種香蕉枯萎菌4號生理小種AGO基因缺失突變體及其小RNA

有效

• 申請號: 201910362416.0
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110016520B
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發明（設計）人: 張欣;曾凡云;彭軍;漆艷香;謝培蘭;謝藝賢
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/113;C12R1/645
• 代理公司: 44202 廣州三環專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳歡

1.一種香蕉枯萎菌4號生理小種AGO基因缺失突變體，其特征在于，所述香蕉枯萎菌4號生理小種AGO基因缺失突變體為以下3種香蕉枯萎菌4號生理小種AGO基因缺失突變體中的任意一種：Δago1突變體、Δago2突變體和Δago1/2突變體；

所述Δago1突變體、Δago2突變體和Δago1/2突變體通過以下方法獲得：

1)構建Foc4 AGO1基因缺失重組DNA片段，采用潮霉素抗性基因HPH替換AGO1基因，原生質體轉化，獲得Foc4 AGO1基因缺失突變體，即Δago1突變體；采用相同的方法敲除AGO2基因，構建Δago2突變體；

2)在Δago1突變體的基礎上構建Foc4 AGO1/2雙基因缺失重組DNA片段，采用新霉素NEO抗性基因替換AGO2基因，原生質體轉化，獲得Foc4 AGO1/2雙基因缺失突變體，即Δago1/2突變體。

2.根據權利要求1所述的香蕉枯萎菌4號生理小種AGO基因缺失突變體，其特征在于，步驟1)Δago1突變體的構建方法為：

第一輪PCR擴增：

左端LB：以FOC4基因組DNA為模板，Foc4AGO1-LBCK和Foc4AGO1-HPH-LB-R為引物，擴增產物大小1993bp；

右端RB：以FOC4基因組DNA為模板，Foc4AGO1-HPH-RB-F和Foc4AGO1-RBCK為引物，擴增產物大小1988bp；

潮霉素抗性基因HPH：載體質粒DNA為模板，HYG-F和HYG-R為引物，擴增產物大小1376bp；

第二輪PCR擴增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH為模板，Foc4AGO1-LB-F和HYG-R1為引物，擴增產物大小2415bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH為模板，HYG-F1和FOC4AGO1-RB-R為引物，擴增產物大小2274bp；

將第二輪PCR片段回收后導入原生質體進行轉化，獲得Foc4 AGO1基因缺失突變體，即Δago1突變體；

其中，Foc4AGO1-LBCK、Foc4AGO1-HPH-LB-R、Foc4AGO1-HPH-RB-F、Foc4AGO1-RBCK、Foc4AGO1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和Foc4AGO1-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:11所示。

3.根據權利要求1所述的香蕉枯萎菌4號生理小種AGO基因缺失突變體，其特征在于，步驟1)Δago2突變體的構建方法為：

第一輪PCR擴增：

左端LB：FOC4基因組DNA為模板，Foc4 AGO2-LBCK和Foc4AGO2-HPH-LB-R為引物，擴增產物大小1840bp；

右端RB：FOC4基因組DNA為模板，Foc4AGO2-HPH-RB-F和Foc4AGO2-RBCK為引物，擴增產物大小1900bp；

潮霉素抗性基因HPH：載體質粒DNA為模板，HYG-F和HYG-R為引物，擴增產物大小1376bp；

第二輪PCR擴增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH為模板，Foc4AGO2-LB-F和HYG-R1為引物，擴增產物大小2411bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH為模板，HYG-F1和Foc4AGO2-RB-R為引物，擴增產物大小2134bp；

其中，Foc4 AGO2-LBCK、Foc4AGO2-HPH-LB-R、Foc4AGO2-HPH-RB-F、Foc4AGO2-RBCK、Foc4AGO2-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和Foc4AGO2-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:17所示。