[發(fā)明專利]一種香蕉枯萎菌4號(hào)生理小種DCL基因缺失突變體及其小RNA

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910362380.6
• 申請(qǐng)日: 2019-04-30
• 公開（公告）號(hào): CN110016519B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭軍;曾凡云;張欣;漆艷香;謝培蘭;謝藝賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/113;C12R1/645
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

本發(fā)明公開了一種香蕉枯萎菌4號(hào)生理小種DCL基因缺失突變體及其小RNA。采用同源置換的原理，構(gòu)建了香蕉枯萎菌Δdcl1、Δdcl2和Δdcl1/2基因缺失突變體，并進(jìn)行了非生物脅迫測(cè)試和致病力分析，結(jié)果顯示經(jīng)過熒光增白劑CFW處理后，Δdcl1、Δdcl2、Δdcl1/2突變體更加敏感，生長受到抑制，MgCl₂處理后，Δdcl1突變體、Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體的生長均受到抑制。Δdcl1突變體致病力增強(qiáng)，Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體致病力減弱；此外，結(jié)合小RNA深度測(cè)序獲得各突變體小RNA，為進(jìn)一步解析香蕉枯萎病的致病機(jī)制，開發(fā)RNA來源的防控措施等提供理論和技術(shù)支撐。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種香蕉枯萎菌4號(hào)生理小種DCL基因缺失突變體及其小RNA，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

小RNA，包括miRNA和siRNA，是一類21-24nt長度的小分子非編碼RNA，通過剪切靶標(biāo)mRNA或轉(zhuǎn)錄抑制的方式導(dǎo)致序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默調(diào)控，均由類似RNase III的核酸內(nèi)切酶Dicer(或Dicer類似蛋白)加工產(chǎn)生。Dicer(DCL)作為一種特異性核糖核酸內(nèi)切酶參與了小RNA生物合成途徑，Dicer的作用機(jī)制分兩步：第一步，Dicer與dsRNA結(jié)合形成酶-dsRNA復(fù)合體，在ATP的作用下將dsRNA解螺旋并將其切割產(chǎn)生5'端磷酸基、3'端羥基且含有2nt核苷酸突出的21-24nt小片段siRNAs；第二步，小片段的siRNA與含有PAZ功能域的Argonaute(AGO)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex,RISC)，該復(fù)合體具有序列特異性的核酸內(nèi)切酶活性，能夠特異性的降解與siRNA同源的靶標(biāo)mRNA。

真菌也能編碼與植物的miRNA類似的miRNA，命名為microRNA類似小RNAs(microRNA-like RNAs，milRNAs)。milRNAs的生物合成途徑與植物和動(dòng)物的miRNA生物途徑有很大的差異，粗糙脈孢菌(N.crassa)中發(fā)現(xiàn)的milRNAs長度一般是19-25nt，具有發(fā)夾卡結(jié)構(gòu)，形成的milRNAs具有5'末端U的偏好性，能夠特異與Argonaute(AGO)蛋白結(jié)合發(fā)揮功能。粗糙脈孢菌中有四條不同的milRNAs生物形成途徑，這些milRNAs通過Dicers、QDE-2、核酸外切酶活性的QIP效應(yīng)蛋白以及具有RNaseⅢ功能域的線粒體核糖體大亞基MRPL3蛋白(mitochondrial ribosomal protein large subunit,MRPL3)的不同組合而產(chǎn)生，其中包括一條不依賴Dicer的milRNA產(chǎn)生途徑(disiRNAs)(Lee et al.,2010)。雖然四種途徑中從基因間隔區(qū)轉(zhuǎn)錄的RNA前體序列長度各異，但都與大多數(shù)的植物和動(dòng)物的miRNA依賴RNAPolymerase II轉(zhuǎn)錄不同，粗糙脈孢菌的milRNA主要依賴Pol III轉(zhuǎn)錄的(Yang et al.,2013)。milR-1是粗糙脈孢菌中豐度最高的miRNA-like RNAs，Xue et al.(2012)以milR-1為研究對(duì)象構(gòu)建了依賴AGO的milR-1離體生物形成的生物化學(xué)研究框架，研究表明milR-1的加工成熟過程可以分為5個(gè)步驟，需要QDE-2、Dicer、QIP以及RNA外來復(fù)合體(exosome)的共同參與(Xue et al.,2012)。