[發(fā)明專利]一種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體及其小RNA

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910362380.6
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110016519B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發(fā)明（設計）人: 彭軍;曾凡云;張欣;漆艷香;謝培蘭;謝藝賢
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/113;C12R1/645
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

1.一種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體，其特征在于，所述香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體為以下3種香蕉枯萎菌4號生理小種DCL基因缺失突變體中的任意一種：Δdcl1突變體、Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體；

所述Δdcl1突變體、Δdcl2突變體和Δdcl1/2突變體通過以下方法獲得：

1)Δdcl1突變體的構建方法為：

第一輪PCR擴增：

左端LB：FOC4基因組DNA為模板，DCL1-LBCK和DCL1-HPH-LB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1699bp；

右端RB：以FOC4基因組DNA為模板，DCL1-HPH-RB-F和DCL1-RBCK為引物，擴增產(chǎn)物大小1920bp；

潮霉素抗性基因HPH：載體質(zhì)粒DNA為模板，HYG-F和HYG-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1376bp；

第二輪PCR擴增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH為模板，DCL1-LB-F和HYG-R1為引物，擴增產(chǎn)物大小2310bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH為模板，HYG-F1和DCL1-RB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小2269bp；

將第二輪PCR片段回收后導入原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，獲得Foc4DCL1基因缺失突變體，即Δdcl1突變體；

其中，DCL1-LBCK、DCL1-HPH-LB-R、DCL1-HPH-RB-F、DCL1-RBCK、DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL1-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；

2)Δdcl2突變體的構建方法為：

第一輪PCR擴增：

左端LB：FOC4基因組DNA為模板，DCL2-LBCK和DCL2-HPH-LB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1957bp；

右端RB：FOC4基因組DNA為模板，DCL2-HPH-RB-F和DCL2-RBCK為引物，擴增產(chǎn)物大小1837bp；

潮霉素抗性基因HPH：載體質(zhì)粒DNA為模板，HYG-F和HYG-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1376bp；

第二輪PCR擴增：

左端LB+HP：左端LB和潮霉素抗性基因HPH為模板，DCL2-LB-F和HYG-R1為引物，擴增產(chǎn)物大小2682bp；

右端PH+RB：右端RB和潮霉素抗性基因HPH為模板，HYG-F1和DCL2-RB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小2103bp；

將第二輪PCR片段回收后導入原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，獲得Foc4DCL2基因缺失突變體，即Δdcl2突變體；

其中，DCL2-LBCK、DCL2-HPH-LB-R、DCL2-HPH-RB-F、DCL2-RBCK、DCL2-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和DCL2-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:20所示；

3)Δdcl1/2突變體的構建方法為：

第一輪PCR擴增：

左端LB：Δdcl1突變體基因組DNA為模板，DCL2-NEO-LBCK和DCL2-NEO-LB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1881bp；

右端RB：FOC4基因組DNA為模板，DCL2-NEO-RB-F和DCL2-NEO-RBCK為引物，擴增產(chǎn)物大小1973bp；

新霉素NEO抗性基因：載體質(zhì)粒DNA為模板，NEO-F和NEO-R為引物，擴增產(chǎn)物大小1370bp；

第二輪PCR擴增：

左端LB+NE：左端LB和新霉素NEO抗性基因為模板，DCL2-NEO-LB-F和NEO-R1為引物，擴增產(chǎn)物大小2288bp；

右端EO+RB：右端RB和新霉素NEO抗性基因為模板，NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R為引物，擴增產(chǎn)物大小2412bp；

將第二輪PCR片段回收后導入原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，獲得Foc4DCL1/2雙基因缺失突變體，即Δdcl1/2突變體；

其中，DCL2-NEO-LBCK、DCL2-NEO-LB-R、DCL2-NEO-RB-F、DCL2-NEO-RBCK、DCL2-NEO-LB-F、NEO-R1、NEO-F1和DCL2-NEO-RB-R的序列依序如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32所示。