[發明專利]II型草魚呼腸孤病毒的微滴式數字PCR檢測試劑盒及其專用引物和探針

在審

• 申請號: 201910361643.1
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN109971890A
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 王浩;唐睿哲;聞金萱
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新

本發明公開了II型草魚呼腸孤病毒的微滴式數字PCR檢測試劑盒及其專用引物和探針，其專用引物和探針：JX02?M?F：5'?CGAGAATAGATGCAGTGGACG?3'，JX02?M?R：5'?CACAAATAACCCTTCTCCCGT?3'，JX02?M?P：5'?熒光基團?TATAGTCGATGACCAGAGG?淬滅基團?3'；將包含上述專用引物和探針的微滴式數字PCR檢測試劑盒用于檢測II型草魚呼腸孤病毒，與傳統PCR技術相比，其不依賴Ct值或內參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，成本低，實用性強。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及II型草魚呼腸孤病毒的檢測技術，具體涉及II型草魚呼腸孤病毒的微滴式數字PCR檢測試劑盒及其專用引物和探針，及在檢測II型草魚呼腸孤病毒的應用。

背景技術

草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起草魚出血病的病原，隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)、水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)。GCRV在中國、越南、緬甸等國家均有報道，其流行廣、危害大、死亡率高、發病季節廣，每年4至9月全國各地均有報道。草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國第一大淡水養殖品種，據2015年全國漁業統計情況記載，我國草魚年產量567.62萬噸，占全國大宗淡水魚類養殖產量的18％左右，是目前全球產量和消費量最大的淡水養殖魚類品種之一。但因病害影響，尤其是草魚出血病的流行，對1齡和2齡幼魚的致死率達80％以上，嚴重影響養殖戶對該品種的養殖積極性。該病不僅能夠感染草魚，還能感染青魚(Mylopharyngodon piceus)、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、鰱(Hypophthalmichthys molitrix)等養殖品種，我國農業部將其列為二類傳染疫病。截至目前研究發現，主要有三種基因型的毒株流行，分別為GCRV-873和GCRV-JX0901(genotype I)，GCRV-HZ08(genotype II)以及HGDRV(genotype III)，II型草魚呼腸孤病毒是我國主要流向毒株。

微滴式數字PCR系統在傳統的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。經PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。與傳統PCR相比，該方法不依賴Ct值或內參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，且微滴技術讓數字PCR成本更低，實用性強。

發明內容

本發明的主要目的在于提供II型草魚呼腸孤病毒的微滴式數字PCR專用引物和探針。

本發明的另一目的在于提供II型草魚呼腸孤病毒的微滴式數字PCR檢測試劑盒，包含上述專用引物和探針，用于檢測草魚呼腸孤病毒時，其不依賴Ct值或內參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目，成本低，實用性強。

本發明的上述目的通過以下技術方案實現：

第一方面，II型草魚呼腸孤病毒的微滴式數字PCR專用引物和探針如下：

JX02-M-F：5'-CGAGAATAGATGCAGTGGACG-3'，

JX02-M-R：5'-CACAAATAACCCTTCTCCCGT-3'，

JX02-M-P：5'-熒光基團-TATAGTCGATGACCAGAGG-淬滅基團-3'；

其中，所述熒光基團為VIC，所述淬滅基團為BHQ-X。

第二方面，II型草魚呼腸孤病毒的微滴式數字PCR檢測試劑盒，包含上述微滴式數字PCR專用引物和探針，還包括陽性對照和陰性對照。