[發明專利]一種CRISPR/Cas9基因編輯系統及其應用

有效

• 申請號: 201910361106.7
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110066829B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 饒志明;林春;邵明龍;張顯;楊套偉;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N1/21;C12R1/32
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種CRISPR/Cas9基因編輯系統及其應用，屬于基因工程技術領域以及生物工程技術領域。此系統可達到對新金色分枝桿菌進行基因編輯的目的；此系統使用的pML?Cas9質粒和pJM?sgRNA質粒就能夠在新金色分枝桿菌中穩定存在、表達，不會隨著新金色分枝桿菌的傳代丟失，也不會被新金色分枝桿菌自身所存在的保護機制排斥；利用此系統的CRISPR/Cas9基因編輯系統系統對新金色分枝桿菌進行基因編輯，敲除效率較高，可達50％。

技術領域

本發明涉及一種CRISPR/Cas9基因編輯系統及其應用，屬于基因工程技術領域以及生物工程技術領域。

背景技術

甾體藥物屬于激素類藥物，是在研究哺乳動物內分泌系統時發現的內源性物質，具有極重要的醫藥價值，在維持生命、調節性功能、機體發育、免疫調節、皮膚疾病治療及生育控制方面均有重要的作用。這些作用使得甾體藥物成為了化藥工業中僅次于抗生素的第二大類藥物，也使得甾體藥物成為了我國藥物新資源開發的重點之一，更使得甾體藥物及甾體藥物中間體成為了我國藥物出口的重要品種。

但是，由于我國在甾體藥物的生產水平上和世界先進國家相比還有一定的差距，我國現有的甾體藥物品種僅為國外已經上市的甾體藥物的三分之一，且大多為中低檔產品，利潤較低。因此，急需提升我國甾體藥物的生產水平。

雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要的甾體藥物中間體，可通過結構上的化學修飾合成幾乎所有的甾體類藥物，在甾體藥物的生產中占據重要地位，然而，由于底物投料濃度低、發酵轉化周期長以及對甾體微生物代謝機理認知的不足等問題，我國在甾體微生物轉化生產上也明顯落后于世界先進國家。因此，急需提升我國甾體藥物中間體ADD的生產水平，進而提升我國甾體藥物的生產水平。

新金色分枝桿菌(Mycobacterium?neoaurum)可轉化植物甾醇合成雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，且具有生長快的優勢，是一種極具潛力的ADD生產菌，若能對新金色分枝桿菌轉化植物甾醇合成ADD過程中的3-甾酮-Δ1-脫氫酶、膽固醇氧化酶、甾酮C27單加氧酶以及3-甾酮-9α-羥化酶等關鍵酶進行研究，并結合代謝工程策略對新金色分枝桿菌的ADD合成相關途徑進行改造，極有可能獲得能夠高效積累ADD的新金色分枝桿菌，此經改造的新金色分枝桿菌無疑是提升我國甾體藥物中間體ADD生產水平的一個重要突破，也為提升我國甾體藥物的生產水平提供了更多可能。

然而，由于新金色分枝桿菌自身所存在的保護機制排他性較強，外源基因很難在新金色分枝桿菌中穩定存在并表達，這就使得可適用于新金色分枝桿菌的基因編輯方法較少，例如，由于分枝桿菌同源重組的發生率比其他細菌明顯低很多，僅為10^-6～10^-5，并且，利用同源重組對新金色分枝桿菌進行基因編輯還需在基因組上帶入抗性標簽，因此，利用同源重組對新金色分枝桿菌進行基因編輯具有效率低、周期長、篩選量大、操作復雜等劣勢；自殺載體系統(pNIL/pGOAL系列質粒)等其他基因編輯方法雖然可以對新金色分枝桿菌進行基因編輯，但效率也不高，與同源重組相比不具備任何優勢。

因此，基因編輯無疑是對新金色分枝桿菌進行代謝工程改造的一個難點，急需完善針對新金色分枝桿菌的基因編輯系統，以便更有效率地對新金色分枝桿菌進行改造。

發明內容

[技術問題]

本發明要解決的技術問題是提供一種對新金色分枝桿菌針對性強且效率高的基因編輯系統。

[技術方案]

為解決上述問題，本發明提供了一種CRISPR/Cas9基因編輯系統，所述CRISPR/Cas9基因編輯系統包含pML-Cas9質粒以及pJM-sgRNA質粒；