[發明專利]一種CRISPR/Cas9基因編輯系統及其應用有效
| 申請號： | 201910361106.7 | 申請日： | 2019-04-30 |
| 公開（公告）號： | CN110066829B | 公開（公告）日： | 2023-04-28 |
| 發明（設計）人： | 饒志明;林春;邵明龍;張顯;楊套偉;徐美娟 | 申請（專利權）人： | 江南大學 |
| 主分類號： | C12N15/90 | 分類號： | C12N15/90;C12N1/21;C12R1/32 |
| 代理公司： | 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211 | 代理人： | 林娟 |
| 地址： | 214000 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 crispr cas9 基因 編輯 系統 及其 應用 | ||
1.一種用于新金色分枝桿菌的基因編輯方法，其特征在于，所述方法為使用一種CRISPR/Cas9基因編輯系統；
所述CRISPR/Cas9基因編輯系統包含pML-Cas9質粒以及pJM-sgRNA質粒；
所述pML-Cas9質粒包含pMV261表達載體、Cas9基因、Pj23119啟動子以及NHEJ修復基因；所述pMV261表達載體上的Hsp60啟動子被替換為了Tac啟動子；所述NHEJ修復基因包含編碼DNA末端結合蛋白mku的基因以及編碼DNA連接酶LigD的基因；所述Cas9基因位于pMV261表達載體的Tac啟動子的下游以及pMV261表達載體的rrnB終止子上游，由Tac啟動子驅動表達；所述Pj23119啟動子位于pMV261表達載體的
所述pJM-sgRNA質粒依次包含OriM復制子、pMB1復制子、Pj23119啟動子、sgRNA序列、rrnB終止子以及
所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；
編碼所述pML-Cas9質粒以及pJM-sgRNA質粒中的Pj23119啟動子的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；
編碼所述DNA末端結合蛋白mku的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示；
編碼所述DNA連接酶LigD的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。
2.如權利要求1所述的一種用于新金色分枝桿菌的基因編輯方法，其特征在于，所述方法為先將權利要求1所述的一種CRISPR/Cas9基因編輯系統中的pML-Cas9質粒導入新金色分枝桿菌中，使得pML-Cas9質粒上的Cas9基因、編碼DNA末端結合蛋白mku的基因以及編碼DNA連接酶LigD的基因表達，然后將權利要求1所述的一種CRISPR/Cas9基因編輯系統中的pJM-sgRNA質粒導入新金色分枝桿菌中，使得pJM-sgRNA質粒轉錄生成sgRNA序列，sgRNA序列中的Cas9?handle和Terminator會形成莖環結構，Cas9基因會識別此莖環結構以與sgRNA序列結合形成復合物，此復合物會靶向需編輯基因并錨定在需編輯基因上，錨定后，Cas9基因會發揮活性切割需編輯基因使得新金色分枝桿菌中需編輯的基因被敲除，需編輯基因的敲除會使得新金色分枝桿菌基因產生DSB斷裂，此時，pML-Cas9質粒上的表達的DNA末端結合蛋白mku以及DNA連接酶LigD會修復DSB斷裂，完成新金色分枝桿菌基因的編輯過程。
3.權利要求1或2所述的一種用于新金色分枝桿菌的基因編輯方法在編輯新金色分枝桿菌基因方面的應用。
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