[發(fā)明專利]Hel112解旋酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用、組合物及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910360658.6
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110066855B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔敬文
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市剛竹醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12P19/34;C12N9/14;C12N15/55;C12N15/70
• 代理公司: 華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 任星宇;何平

Hel112解旋酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用、組合物及試劑盒；Hel112解旋酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用，Hel112解旋酶添加至PCR的反應(yīng)體系中，以增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性。此外，Hel112解旋酶添加至PCR的反應(yīng)體系中，還能夠提高PCR的反應(yīng)速率，提高PCR目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種Hel112解旋酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用、增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的組合物及包括該組合物的試劑盒。

背景技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)是分子生物學(xué)中一種核酸擴(kuò)增的重要技術(shù)手段，已廣泛用于臨床的疾病診斷和預(yù)防中。PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和準(zhǔn)確度主要由擴(kuò)增特異性、靈敏度和擴(kuò)增效率等三項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)決定，為了改善PCR的擴(kuò)增效果，研究人員通常設(shè)法提高該三方面的技術(shù)指標(biāo)，以提高PCR臨床檢測的可靠性。在上述三項(xiàng)的技術(shù)指標(biāo)中，顯著的擴(kuò)增特異性是高靈敏度和高擴(kuò)增效率的前提，也是改善PCR檢測準(zhǔn)備性的主要研究方向。

在PCR技術(shù)發(fā)明初期，為了提高PCR的擴(kuò)增特異性，在PCR循環(huán)開始，反應(yīng)液加熱到變性溫度時加入DNA聚合酶，以此方法改善PCR特異性，隨著技術(shù)的進(jìn)步，逐漸發(fā)展到石蠟物理分隔反應(yīng)組分、抗體修飾DNA聚合酶、化學(xué)修飾DNA聚合酶、修飾引物等等方法加以實(shí)現(xiàn)，在一定程度上提高了PCR擴(kuò)增特異性，改善了擴(kuò)增效果，但在一些情況下仍然存在非特異性擴(kuò)增。

針對DNA聚合酶進(jìn)行著手以提高PCR擴(kuò)增特異性，為目前最常用的提高PCR特異性方法，包括化學(xué)修飾DNA聚合酶和在反應(yīng)體中加入DNA聚合酶抗體。PCR中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的原因主要由于DNA聚合酶在較低的溫度下，如室溫，仍然具有較強(qiáng)的活性，導(dǎo)致在反應(yīng)體系配制過程和進(jìn)入PCR循環(huán)的退火階段中，引物之間或者引物與模板非目的序列進(jìn)行配對，經(jīng)過PCR循環(huán)后，非目的序列獲得大量擴(kuò)增，出現(xiàn)了明顯的副產(chǎn)物。利用化學(xué)方法，對DNA聚合酶進(jìn)行修飾，可封閉DNA聚合酶活性，避免了反應(yīng)體系配制過程中出現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)，從而減少非特異產(chǎn)物產(chǎn)生；同理，DNA聚合酶抗體同樣也可封閉DNA聚合酶活性，以防止非特異產(chǎn)物產(chǎn)生，同樣可改善PCR的擴(kuò)增特異性。但是，上述兩種方法對DNA聚合酶活性封閉不徹底，仍然存在一定程度的非特異性擴(kuò)增，而且上述兩種方法DNA聚合酶的制備工藝復(fù)雜，生產(chǎn)條件苛刻，成本較高，進(jìn)一步限制其應(yīng)用。

因此，仍需要一種方法進(jìn)一步提高PCR的擴(kuò)增特異性，以進(jìn)一步提高PCR的檢測準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，有必要提供一種能夠增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的Hel112解旋酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用、增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的組合物及試劑盒。

Hel112解旋酶在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用，Hel112解旋酶添加至PCR的反應(yīng)體系中，以增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性。此外，Hel112解旋酶添加至PCR的反應(yīng)體系中，還能夠提高PCR的反應(yīng)速率，提高PCR目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

在其中一個實(shí)施例中，Hel112解旋酶在PCR的反應(yīng)體系中的濃度為0.001ng/μl至10ng/μl。

在其中一個實(shí)施例中，Hel112解旋酶在PCR的反應(yīng)體系中的濃度為1ng/μl至4ng/μl。

在其中一個實(shí)施例中，所述Hel112解旋酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1。

在其中一個實(shí)施例中，Hel112解旋酶為SsoHel112解旋酶。

一種用于增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性的組合物，所述組合物包括Hel112解旋酶，Hel112解旋酶用于添加至PCR的反應(yīng)體系中，以增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增特異性。

在其中一個實(shí)施例中，所述Hel112解旋酶的表達(dá)基因的堿基序列為SEQ?ID?NO.2。

在其中一個實(shí)施例中，所述Hel112解旋酶的制備方法包括如下步驟：