[發明專利]用于分枝桿菌菌種鑒定的寡核苷酸組合、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201910360038.2
• 申請日: 2019-04-29
• 公開（公告）號: CN110079621B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發明（設計）人: 戴立忠;孫青芝;任小梅;譚德勇;毛君杰;李倩;程星;鄧中平
• 申請（專利權）人: 圣湘生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 李強;張穎玲

本發明涉及分子學生物檢測領域，更具體的，涉及分枝桿菌鑒定領域。本發明提供了一種寡核苷酸組合，包括檢測偶然分枝桿菌的寡核苷酸，以及檢測胞內分枝桿菌的寡核苷酸，可選地還包括選自其余三組中的至少一組，其可特異性地檢測結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，并鑒定至具體種/亞種，同時還實現一個通道同時檢測兩種分枝桿菌，擴大了熒光PCR檢測分枝桿菌的數量；本發明還提供了包含該寡核苷酸組合的試劑盒以及用于鑒定分枝桿菌的方法。

技術領域

本發明屬于分子學生物檢測領域，更具體的，屬于分枝桿菌鑒定領域。

背景技術

分枝桿菌(Mycobacterium)是一類細長略彎曲的，有時有分枝或出現絲狀體的菌。分枝桿菌種類較多，主要包括結核分枝桿菌復合群(mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)，和非結核分枝桿菌。

結核分枝桿菌(M.tuberculosis，TB)，俗稱結核桿菌，是引起結核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺結核為最多見。結核病至今仍為重要的傳染病。據WHO報道，每年約有800萬新病例發生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛生狀態改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結核病的發病率和死亡率大為降低。但應注意，世界上有些地區因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應用、酗酒和貧困等原因，發病率又有上升趨勢。

非結核分枝桿菌(none—tuberculous Mycobacteria，NTM)，也曾稱為非典型分枝桿菌(Mycobacteria other than tuberculosis，MOTT)。隨著醫務工作者對相關疾病認識的提高、菌種鑒定技術的進步以及免疫缺陷性疾病和免疫抑制劑使用增多等因素，臨床觀察到的與NTM相關的疾病呈明顯增多趨勢。臨床對NTM感染疾病診斷和治療需求的增加促使對臨床實驗室檢驗能力要求的不斷提升。NTM在肺器官上的感染癥狀與TB類似。NTM在環境中普遍存在，以土壤和水中最為常見，水源性NTM與人類感染的關系最為密切。隨著鑒定技術的進步，已報道的分枝桿菌菌種數量越來越多，目前已超過170種。臨床最常見的有臨床價值包括膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌和龜分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌以及蟾蜍分枝桿菌等。

目前，常見的分枝桿菌的鑒定方法有三種：生化試驗、初步菌種鑒定方法和具體菌種鑒定方法。其中，生化試驗雖然曾經是經典方法，但由于操作復雜、耗時而結果不準確，因此已不常使用。初步菌種鑒定方法僅能鑒別MTBC和NTM，具體菌種鑒定方法雖然能夠鑒別至種水平，但鑒定的菌種很少，且準確性和靈敏度不高。

熒光定量PCR是一種對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程的檢測方法；結合相應的軟件可以對產物進行分析，具有反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰的特點。目前已有使用熒光定量PCR鑒定分枝桿菌的報道，例如，中國發明專利(公開號：CN101413031A)公開了一種采用熒光PCR鑒定分枝桿菌的方法以及試劑盒，所述試劑盒包括引物1、2、3、4和探針1、2，能夠將結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌區分開。然而，該試劑盒或方法不能將分枝桿菌鑒定到具體種，且無法同時對多個分枝桿菌菌種/亞種進行檢測，除此之外也并未對靈敏度以及準確度進行驗證。

因此，存在對同時鑒定多個分枝桿菌種/亞種的高靈敏度試劑的強烈需求。

發明內容

有鑒于此，在第一方面，本發明提供了一種寡核苷酸組合，包括：

第一組：檢測偶然分枝桿菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:5、6和19所示，以及檢測胞內分枝桿菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:11、12、23和27所示，可選地還包括選自以下組中的至少一組：

第二組：檢測堪薩斯分枝桿菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:1、2和17所示，以及檢測膿腫分枝膿腫亞種的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:7、8、21和25所示；