[發(fā)明專利]一種植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910360007.7
• 申請(qǐng)日: 2019-04-30
• 公開（公告）號(hào): CN110066828A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)重科技（武漢）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89;C12N5/10
• 代理公司: 湖北天領(lǐng)艾匹律師事務(wù)所 42252
• 代理人: 程明

本發(fā)明公開了一種植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞制備方法，包括如下步驟：從植物供體中采用酶切法獲取目的基因，用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，目的基因的擴(kuò)增步驟為：將目的基因倒入加熱容器中，調(diào)節(jié)溫度，加熱至90～95℃，持續(xù)1?2分鐘，DNA解鏈,降低溫度，將溫度調(diào)節(jié)到45?55℃，并加入引物、四種脫氧核苷酸和DNA聚合酶，結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈,升高溫度，將溫度調(diào)節(jié)到70?75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成，選取載體和目的基因構(gòu)建基因載體，通過基因槍將基因載體導(dǎo)入受體細(xì)胞,本發(fā)明通過堿性磷酸酶抑制環(huán)化分子的產(chǎn)生，使得基因上的粘性末端可以和質(zhì)粒載體上的粘性切口相粘結(jié)，使得基因表達(dá)載體生成，提高基因表達(dá)載體生成的數(shù)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞制備方法。

背景技術(shù)

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動(dòng)物、植物或微生物中分離到的目的基因，通過各種方法轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，使之穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等。

轉(zhuǎn)基因植物是擁有來自其他物種基因的植物。該基因變化過程可以來自不同物種之間的雜交，但今天該名詞更多的特指那些在實(shí)驗(yàn)室里通過重組DNA技術(shù)人工插入其他物種基因以創(chuàng)造出擁有新特性的植物。轉(zhuǎn)基因植物的研究主要在于改進(jìn)植物的品質(zhì)，改變生長(zhǎng)周期或花期等提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值或觀賞價(jià)值，以植物作為生物技術(shù)的實(shí)驗(yàn)材料有其特定的優(yōu)點(diǎn)，那就是植物細(xì)胞大部分都有全能性，可以用單個(gè)細(xì)胞分化發(fā)育出整個(gè)植株。這樣，經(jīng)過基因工程改造的單個(gè)植物細(xì)胞有可能再生成一棵完整的轉(zhuǎn)基因植株。植物基因工程用作外源基因的轉(zhuǎn)化受體有許多種，包括胚性愈傷組織、分生細(xì)胞、幼胚、成熟胚、受精胚珠、種子和原生質(zhì)體等。從這些受體細(xì)胞都可獲得再生的轉(zhuǎn)基植株。現(xiàn)有的基因細(xì)胞在制備過程中，容易生成載體環(huán)化分子，降低基因細(xì)胞的制備效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出了一種植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

本發(fā)明提出了一種植物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞制備方法，包括如下步驟：

S1：從植物供體中采用酶切法獲取目的基因；

S2：用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，目的基因的擴(kuò)增步驟為：

A：將目的基因倒入加熱容器中，調(diào)節(jié)溫度，加熱至90～95℃，持續(xù)1-2分鐘，DNA解鏈；

B：降低溫度，將溫度調(diào)節(jié)到45-55℃，并加入引物、四種脫氧核苷酸和DNA聚合酶，結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；

C：升高溫度，將溫度調(diào)節(jié)到70-75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成；

S3：選取載體和目的基因構(gòu)建基因載體；

S4：通過基因槍將基因載體導(dǎo)入受體細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述S1中，目的基因的獲取步驟為：

(1)、從植物供體中制備純度為90％以上的染色體基因組DNA；

(2)、向基因組DNA溶液中加入一定量的限制酶，限制酶將DNA切割成若干個(gè)片段；

(3)、將DNA片段分別與適當(dāng)?shù)妮d體分子進(jìn)行體外連接；

(4)、將重組的載體包裝成噬菌體,放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，保持適宜的溫度，并加入培養(yǎng)液；

(5)、觀察培養(yǎng)基中的噬菌斑,篩選陽(yáng)性克隆,再將其克隆中的目的基因提取分離出來，得到目的基因。

優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液為水、無機(jī)鹽、維生素、蔗糖、氨基酸和激素的混合物，植物細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)需要植物激素的調(diào)節(jié)，促進(jìn)生長(zhǎng)的生長(zhǎng)素和促進(jìn)細(xì)胞分裂的分裂素是最基本的激素，激素是由吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素混合而成，且吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素的質(zhì)量比例的1:2。