[發明專利]一種植物轉基因細胞制備方法

在審

• 申請號: 201910360007.7
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110066828A
• 公開（公告）日: 2019-07-30
• 發明（設計）人: 盧娜
• 申請（專利權）人: 國重科技（武漢）有限公司
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N5/10
• 代理公司: 湖北天領艾匹律師事務所 42252
• 代理人: 程明

1.一種植物轉基因細胞制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：從植物供體中采用酶切法獲取目的基因；

S2：用PCR技術擴增目的基因，目的基因的擴增步驟為：

A：將目的基因倒入加熱容器中，調節溫度，加熱至90～95℃，持續1-2分鐘，DNA解鏈；

B：降低溫度，將溫度調節到45-55℃，并加入引物、四種脫氧核苷酸和DNA聚合酶，結合到互補DNA鏈；

C：升高溫度，將溫度調節到70-75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成；

S3：選取載體和目的基因構建基因載體；

S4：通過基因槍將基因載體導入受體細胞。

2.根據權利要求1所述的一種植物轉基因細胞制備方法，其特征在于，所述S1中，目的基因的獲取步驟為：

(1)、從植物供體中制備純度為90％以上的染色體基因組DNA；

(2)、向基因組DNA溶液中加入一定量的限制酶，限制酶將DNA切割成若干個片段；

(3)、將DNA片段分別與適當的載體分子進行體外連接；

(4)、將重組的載體包裝成噬菌體,放入培養基中培養，保持適宜的溫度，并加入培養液；

(5)、觀察培養基中的噬菌斑,篩選陽性克隆,再將其克隆中的目的基因提取分離出來，得到目的基因。

3.根據權利要求2所述的一種植物轉基因細胞制備方法，其特征在于，所述培養液為水、無機鹽、維生素、蔗糖、氨基酸和激素的混合物，植物細胞的分裂和生長需要植物激素的調節，促進生長的生長素和促進細胞分裂的分裂素是最基本的激素，激素是由吲哚乙酸和細胞分裂素混合而成，且吲哚乙酸和細胞分裂素的質量比例的1:2。

4.根據權利要求1所述的一種植物轉基因細胞制備方法，其特征在于，所述S2中，PCR技術擴增目的基因過程中，在引入酶切位點后，加入凝血酶，促進細胞的分裂，擴增目的基因。

5.根據權利要求1所述的一種植物轉基因細胞制備方法，其特征在于，所述S3中，選取質粒載體，在質粒載體上剪出帶有粘性末端的切口，將帶有相同粘結末端的目的基因片段導入切口內，添加DNA連接酶和抑制劑，生成基因表達載體。

6.根據權利要求5所述的一種植物轉基因細胞制備方法，其特征在于，所述抑制劑為堿性磷酸酶，在目的基因上的粘性末端與質粒載體上的粘性切口粘接時，會產生一定數量的載體環化分子，堿性磷酸酶抑制環化分子的產生，使得基因上的粘性末端可以和質粒載體上的粘性切口相粘結，使得基因表達載體生成，提高基因表達載體生成的數量。

7.根據權利要求1所述的一種植物轉基因細胞制備方法，其特征在于，所述S4中，基因載體導入受體的過程為將直徑4um的鎢粉或金粉在供體DNA中浸泡2-3分鐘，然后啟動基因槍，將這些粒子打入細胞、組織或器官中，小顆粒穿鎢粉或金粉透力強，不需除去細胞壁和細胞膜而進入基因組，實現穩定轉化，基因槍轉化時間短，轉化頻率高。