[發(fā)明專利]一種基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測(cè)方法及探針

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910359662.0
• 申請(qǐng)日: 2019-04-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110066865B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡微菁;孫子豪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 常州桐樹生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6876
• 分類號(hào): C12Q1/6876;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 上海元好知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31323
• 代理人: 賈慧琴;劉琰

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于CRISPR?Cas13a的特異性核酸片段的檢測(cè)方法，該方法的檢測(cè)體系中含有：crRNA、Cas13a、探針；該方法的特征在于：所述的探針包含1段RNA序列，該RNA序列的兩端分別連接1段DNA序列；所述探針上的核苷酸均進(jìn)行硫代磷酸骨架的修飾，以在相鄰核苷酸之間形成硫代磷酸酯鍵；所述RNA序列上的若干個(gè)核苷酸還進(jìn)行了二甲氧基修飾，并且，所述的RNA序列上至少含有兩個(gè)連續(xù)的未進(jìn)行二甲氧基修飾的核苷酸。所述的DNA序列含有6個(gè)脫氧核糖核苷酸。所述的RNA序列含有為8?12個(gè)核糖核苷酸。本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針?lè)€(wěn)定高，熒光背景值低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測(cè)方法及探針。

背景技術(shù)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)細(xì)菌與所有的古菌中的一種免疫系統(tǒng)，被用來(lái)識(shí)別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。在CRISPR/Cas系統(tǒng)中，CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)的簡(jiǎn)稱，涉及細(xì)菌基因組中的獨(dú)特DNA區(qū)域，也是儲(chǔ)存病毒DNA片段從而允許細(xì)胞能夠識(shí)別任何試圖再次感染它的病毒的地方，CRISPR經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA序列識(shí)別入侵性病毒的遺傳物質(zhì)。Cas是CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)的簡(jiǎn)稱，Cas蛋白像一把分子剪刀那樣切割細(xì)菌基因組上的靶DNA。CRISPR-Cas系統(tǒng)是古菌和細(xì)菌的抵抗病毒和質(zhì)粒侵染的重要免疫防御系統(tǒng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)劃分為兩大類，第一大類CRISPR-Cas系統(tǒng)由多亞基組成的效應(yīng)復(fù)合物發(fā)揮功能；第二大類是由單個(gè)效應(yīng)蛋白(如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等)來(lái)發(fā)揮功能。其中，Cas9、Cpf1、C2c1和C2c2(C2c2也被稱作Cas13a)均具有RNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶活性。

2017年Science期刊在線發(fā)表論文標(biāo)題為“Nucleic acid detection withCRISPR-Cas13a/C2c2”的文章，公開(kāi)了一種基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測(cè)方法，引發(fā)了全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。研究人員將一種靶向RNA(而不是DNA)的CRISPR相關(guān)酶(即Cas13a)改造為一種快速的、廉價(jià)的和高度靈敏的診斷工具，能夠指示最少至一個(gè)靶RNA或DNA分子的存在。這種新的工具被稱為“SHERLOCK(Specific High-sensitivityEnzymatic Reporter unLOCKing)”。SHERLOCK”系統(tǒng)除了包含Cas13a以及對(duì)應(yīng)的靶向待檢測(cè)病毒的crRNA外，還包含一個(gè)切割后可發(fā)出熒光的RNA探針。Cas13a一旦識(shí)別并切割由crRNA序列指定的靶標(biāo)RNA，就會(huì)轉(zhuǎn)入一種酶促“激活”狀態(tài)，這時(shí)它將結(jié)合并切割其它的非靶標(biāo)RNA，而不管它們是否與crRNA同源。此時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)中的RNA探針被Cas13a核酸酶識(shí)別并切割，發(fā)出熒光信號(hào)，表明已經(jīng)檢測(cè)到了靶標(biāo)序列的存在。