[發明專利]一種基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法及探針

有效

• 申請號: 201910359662.0
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110066865B
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 蔡微菁;孫子豪
• 申請（專利權）人: 常州桐樹生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 上海元好知識產權代理有限公司 31323
• 代理人: 賈慧琴;劉琰

1.一種基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，該方法用于非診斷目的的檢測，該方法的檢測體系中含有：crRNA、Cas13a、探針；所述的crRNA包含針對目的基因的靶點設計的向導序列；所述的Cas13a通過所述的crRNA識別目的基因上的靶點后，能夠激活Cas13a的RNA酶活性，并對所述的探針進行切割，從而獲得檢測信號；該方法的特征在于：

所述的探針包含1段RNA序列，該RNA序列的兩端分別連接1段DNA序列；所述探針上的核苷酸均進行硫代磷酸骨架的修飾，以在相鄰核苷酸之間形成硫代磷酸酯鍵；所述RNA序列上的若干個核苷酸還進行了二甲氧基修飾，并且，所述的RNA序列上至少含有兩個連續的未進行二甲氧基修飾的核苷酸。

2.根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述的DNA序列含有6個脫氧核糖核苷酸。

3.根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述的RNA序列含有為8-12個核糖核苷酸。

4.根據權利要求3所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述的RNA序列中，進行了二甲氧基修飾的核苷酸的個數為4個。

5.根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述探針的序列為：

ATCTTCGUCGCCCUGGCATACGTT；

該探針前端的6個核苷酸以及后端的6個核苷酸分別組成DNA序列，探針的第11至第14個核苷酸進行了二甲氧基修飾。

6.根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述的探針還包含：分別與探針兩端的DNA序列連接，用于產生檢測信號的第一修飾基團和第二修飾基團。

7.根據權利要求6所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述的第一修飾基團和第二修飾基團分別為熒光報告基團和熒光猝滅基團。

8.根據權利要求6所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述的第一修飾基團和第二修飾基團分別為5/6-羧基熒光素和Biotin。

9.根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法，其特征在于，所述的目的基因為CYP2C19基因，針對CYP2C19基因的*2或*3位點設計向導序列；所述的向導序列與包含*2位點的針對性序列互補，或與包含*3位點的針對性序列互補；其中，

包含CYP2C19基因*2位點的針對性序列為：

TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG；

包含CYP2C19基因*3位點的針對性序列為：

AAACATCAGGATTGTAGCACCCCCTGG。

10.權利要求1-9任一項所述的基于CRISPR-Cas13a的特異性核酸片段的檢測方法中采用的探針。