[發(fā)明專利]一種茶樹熱激蛋白CssHSP-6基因的重組載體和表達方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910357329.6 | 申請日： | 2019-04-29 |
| 公開（公告）號： | CN110117604A | 公開（公告）日： | 2019-08-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 謝鑫;李向陽;蔣君梅;任明見 | 申請（專利權(quán)）人： | 貴州大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/66 | 分類號： | C12N15/66;C12N15/70;C12P21/02;C07K14/415 |
| 代理公司： | 貴陽中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100 | 代理人： | 張行超 |
| 地址： | 550025 貴州省貴*** | 國省代碼： | 貴州;52 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 茶樹熱激蛋白 基因 重組載體 抗病性 原核表達載體 可溶性蛋白 生物學(xué)特性 蛋白表達 蛋白晶體 茶樹 構(gòu)建 優(yōu)化 研究 | ||
本發(fā)明公開了一種茶樹熱激蛋白CssHSP?6基因的重組載體，本發(fā)明還公開一種茶樹熱激蛋白CssHSP?6基因的表達方法。本發(fā)明構(gòu)建了茶樹熱激蛋白CssHSP?6基因的原核表達載體，并且針對蛋白表達條件進行一系列的優(yōu)化，最終得到CssHSP?6可溶性蛋白，其結(jié)果為進一步研究蛋白晶體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)，進而為通過基因編輯方法提高茶樹的抗病性提供依據(jù)。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種茶樹熱激蛋白CssHSP-6基因的重組載體和表達方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
茶樹，原名：茶，山茶科、山茶屬灌木或小喬木，嫩枝無毛。葉革質(zhì)，長圓形或橢圓形。茶樹的葉子可制茶(有別于油茶樹)，種子可以榨油，茶樹材質(zhì)細(xì)密，其木可用于雕刻。分布主要集中在南緯16度至北緯30度之間，茶樹喜歡溫暖濕潤氣候，平均氣溫10℃以上時芽開始萌動，生長最適溫度為20～25℃；年降水量要在1000毫米以上；喜光耐陰，適于在漫射光下生育；一生分為幼苗期、幼年期、成年期和衰老期。
熱激蛋白是一類在有機體受到高溫等逆境刺激后大量表達的蛋白質(zhì)，是生物對逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組成成分,對減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。它最早是1962年在果蠅中發(fā)現(xiàn)并于1974年首先分離得到，現(xiàn)已證明它普遍存在于動物、植物、微生物中。
基因的原核表達是研究基因功能的常用技術(shù)之一。蛋白原核表達時常常存在大腸桿菌中由于稀有密碼子造成表達限制，形成包涵體；毒性較強的蛋白表達時會抑制蛋白的表達，造成表達產(chǎn)量過低；另外一個容易忽視的問題是大腸桿菌內(nèi)還原性過高會導(dǎo)致二硫鍵不能正確形成，導(dǎo)致表達產(chǎn)物不溶。針對上述難題，通常的做法是將包涵體用尿素溶解后在變性的情況下進行純化，然后復(fù)性。但此方法步驟繁瑣，成功率低。目前茶樹熱激蛋白CssHSP-6基因已被發(fā)現(xiàn)，但如何將其以可溶性形式表達出來尚是本領(lǐng)域的難題。本發(fā)明通過選用不同的細(xì)菌菌株、采用不同的誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)劑IPTG的濃度來篩選CssHSP-6蛋白可溶性表達的條件，為基因功能學(xué)、蛋白質(zhì)晶體等研究打下基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種茶樹熱激蛋白CssHSP-6基因的重組載體和表達方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種茶樹熱激蛋白CssHSP-6基因的重組載體，所述重組載體的制備方法如下：提取茶樹葉片的RNA，并反轉(zhuǎn)錄出cDNA；以cDNA為模板擴增CssHSP-6基因；將CssHSP-6擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后，通過DNA連接酶插入到經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達載體中，得到重組質(zhì)粒pET-28a-CssHSP-6。
優(yōu)選地，以cDNA為模板，利用以下引物擴增CssHSP-6基因，引物序列如下：
上游引物：CssHSP-6-F：GC
下游引物：CssHSP-6-R：CG
上下游引物分別如SEQ ID NO.3、4所示。
本發(fā)明還提供一種表達茶樹熱激蛋白CssHSP-6基因的方法，包括以下步驟：
(1)用權(quán)利要求1或1所述的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，得到表達CssHSP-6的重組原核表達菌株；
(2)將重組原核表達菌株接種到卡那霉素液體培養(yǎng)基或卡那霉素+氯霉素液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)活化菌株；
(3)將活化的重組原核表達菌株再轉(zhuǎn)接到卡那霉素液體培養(yǎng)基或卡那霉素+氯霉素液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)重組CssHSP-6的表達；
(4)誘導(dǎo)完成后，回收并純化所表達的CssHSP-6重組蛋白。
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