[發(fā)明專利]一種通用的短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910345696.4
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110229871B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙琪;金云舟;王麗
• 申請（專利權(quán)）人: 上海晶準生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6858
• 代理公司: 上海申新律師事務(wù)所 31272
• 代理人: 車超平

本發(fā)明提供一種通用的短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備方法，其包括如下步驟：(1)根據(jù)STR基因座設(shè)計并合成引物及質(zhì)粒；(2)采用引物，以質(zhì)粒作為擴增模板，進行PCR擴增反應(yīng)；(3)對PCR擴增產(chǎn)物進行純化，適當(dāng)稀釋后獲得STR等位基因階梯。本發(fā)明僅需要合成1個質(zhì)粒、1次PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進行純化稀釋后即可得到相應(yīng)STR基因座的allele?ladder，大大簡化了STR基因座allele?ladder的制備流程、制備的人力成本、時間成本與經(jīng)濟成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種通用的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)等位基因階梯((Allele?Ladder)的制備方法及其試劑盒。

背景技術(shù)

在人以及各種基因組中均存在一種稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short?tandem?repeat，STR)的遺傳標記。STR廣泛應(yīng)用與遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的研究，尤其是那些在人群中具有高度多態(tài)性的STR遺傳標記。如Dib?C與其同事于1996年(Nature.1996?Mar?14；380(6570):152-4.PMID:8600387)、Broman?KW等于1998年(Am?J?Hum?Genet.1998Sep；63(3):861-9.PMID:9718341)、Kong?A等于2002年(Nat?Genet.2002Jul；31(3):241-7.PMID:12053178)分別采用5236個、8325個、5136個STR遺傳標記進行了高分辨的人類基因組遺傳作圖。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，STR標記更成為進行個體識別與親權(quán)認定的標準遺傳標記，國際上如美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ThermoFisher公司子品牌，https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/industrial/forensics/human-identification.html)、Promega公司(https://www.promega.com.cn/)等旗下均有多種基于STR遺傳標記的法醫(yī)學(xué)身份識別產(chǎn)品。2017年，美國FBI對法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的核心STR基因座進行了擴展(https://www.fbi.gov/about-us/lab/biometric-analysis/codis/planned-process-and-timeline-for-implementation-of-additional-codis-core-loci,HaresDR,2015,Forensic?Sci.Int.Genet.17:33-34.)。國內(nèi)也有公司基于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用STR基因座組合開發(fā)出不同的法醫(yī)學(xué)產(chǎn)品并申請了相應(yīng)的專利，如CN105368958A、CN103789414B、CN104017895B、CN103789414B等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，也出現(xiàn)了依據(jù)STR遺傳標記進行疾病診斷等的專家共識(2016，熒光定量PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用協(xié)組，中華婦產(chǎn)科雜志，51.5：321-324)。

在各種類型的STR遺傳標記中，以3-5個堿基為核心重復(fù)單元的遺傳標記最為常用，前述法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中各STR基因型分型試劑盒均屬此類。在各STR基因分型試劑盒中，一個關(guān)鍵的組份是等位基因階梯(allele?ladder)，其作用在于對樣本進行相應(yīng)STR分型時作為STR等位基因的標準參考品。以D13S317為例，其核心重復(fù)序列為[TATC]n，其常見的核心重復(fù)次數(shù)為5-15。那么當(dāng)采用某一對PCR引物對D13S317進行基因分型時，其相應(yīng)的等位基因階梯中就應(yīng)該包含這些常見重復(fù)次數(shù)所對應(yīng)長度的PCR擴增片段。當(dāng)一個樣本采用同樣的PCR引物進行擴增時，擴增片段長度與等位基因階梯的片段長度進行比對，若與核心重復(fù)次數(shù)10相應(yīng)的片段長度相等，則該等位基因即命名為10。顯然，對同一個STR基因座，采用不同的PCR擴增引物，同樣的等位基因的擴增長度極有可能是不同的，必須依據(jù)相同的PCR引物重新制備相應(yīng)的等位基因階梯。如此，才可以確保依據(jù)不同的產(chǎn)品對同一個樣本的等位基因命名都是一致的，使結(jié)果具有可比性。由此，可以看出STR基因座的allele?ladder的制備在相應(yīng)STR分型產(chǎn)品中的重要性。