[發明專利]一種通用的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法

有效

• 申請號: 201910345696.4
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110229871B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 趙琪;金云舟;王麗
• 申請（專利權）人: 上海晶準生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6858
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 車超平

1.一種通用的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)根據STR基因座設計并合成引物及質粒；

(2)采用引物，以質粒作為擴增模板，進行PCR擴增反應；

(3)對PCR擴增產物進行純化，適當稀釋后獲得STR等位基因階梯；

其中，所述步驟(1)中的質粒包括如下所示的結構：

其中，根據STR基因組參考序列設計擴增引物：正向引物F、反向引物R及長引物FPx；

repeat及P均表示核心重復結構域中的核心重復單元；

F為正向引物F對應的DNA片段；

b5為正向引物F與重復結構域間的側翼序列；

Rc為反向引物R的反向互補序列對應的DNA片段；

b3為核心重復結構域與Rc間的側翼序列；

虛線所示為質粒骨架序列；

長引物FPx中P的重復單元數為x，其DNA片段由正向引物F的DNA片段和x個重復單元對應堿基構成；

[repeat]z的重復單元數為z：

z＝y+x-1；其中，y為STR等位基因階梯需包含的DNA片段數，y＝(m+1)-(n-1)+1＝m-n+3，n：核心重復結構域中的最小重復次數，m：核心重復結構域中的最大重復次數；

b5+b3序列中需隨機散在插入的重復單元數k＝m-z+1；

所述STR基因座為D13S317基因座，P的重復單元數x為4，repeat的重復單元數z為16，b5+b3序列中需隨機散在插入的重復單元數為0，m＝15，n＝15。

2.根據權利要求1所述的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括多個STR基因座的總的等位基因階梯的制備：其對每一STR基因均采用步驟(1)和步驟(2)獲得每一STR基因座的擴增產物，對每一擴增產物進行純化、定量，并進行濃度均一化，均一化后進行等份混合，適當稀釋后獲得總的等位基因階梯。

3.根據權利要求1所述的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，正向引物F與反向引物R的工作濃度為200-500nmol/L，長引物FPx的工作濃度為正向引物F工作濃度的1/100至1/500；質粒的工作濃度為1×10⁵拷貝/μL至1×10⁹拷貝/μL。

4.根據權利要求1所述的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，PCR擴增反應的條件為：先將退火溫度設置在35-55度，共進行8-16個循環，隨后再以F與R引物設計退火溫度進行PCR反應，總PCR循環數35-45。

5.根據權利要求1所述的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，PCR擴增產物的稀釋倍數為100-10000倍。

6.根據權利要求1所述的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，正向引物F序列如SEQ?ID?No.1所示，反向引物R序列如SEQ?ID?No.2所示，反向互補序列Rc如SEQID?No.3所示，b5序列如SEQ?ID?No.4所示，b3序列如SEQ?ID?No.5所示，引物FP4序列如SEQID?No.6所示，質粒包含如SEQ?ID?No.7所示的序列。

7.根據權利要求6所述的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，正向引物F的5'末尾添加三堿基修飾，反向引物R的5'端采用熒光素修飾。

8.根據權利要求6所述的短串聯重復序列等位基因階梯的制備方法，其特征在于，所述PCR擴增的熱循環條件為：95℃15min，1個循環；94℃45s、45℃60s、72℃60s，10個循環；94℃45s、62℃60s、72℃60s，30個循環；60℃30min，1個循環。

9.一種由權利要求1～8中任一項所述的制備方法制得的短串聯重復序列等位基因階梯。

10.一種含有權利要求9所述的短串聯重復序列等位基因階梯的試劑盒。