[發明專利]一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法

在審

• 申請號: 201910345204.1
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110129332A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: 吳小鋒;張健家;沈運旺
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/866;C07K14/415;C07K1/22
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

1.一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法，其特征在于：

(1)蓖麻毒素蛋白A鏈編碼基因的克隆：以蓖麻籽抽提獲得的總RNA為模板，利用RT-PCR系統一步克隆獲得蓖麻毒素蛋白A鏈基因的PCR產物；

(2)含有蓖麻毒素蛋白A鏈基因的重組桿狀病毒的構建：用限制性內切酶BamHI和HindIII消化PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A鏈得到蓖麻毒素蛋白A鏈基因片段，然后將蓖麻毒素蛋白A鏈基因片段克隆入桿狀病毒轉移載體pBlueBacHisA獲得重組體pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A鏈；通過共轉染在家蠶培養細胞BmN內將重組體pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A鏈與家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的基因同源重組產生重組病毒；

(3)家蠶體內表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈：使用家蠶幼蟲5齡起蠶，經口接種上述重組病毒進行感染表達，將涂布有病毒液的桑葉飼喂家蠶，然后在23-25℃下飼養；在飼養96小時后收集家蠶幼蟲；從家蠶幼蟲中收集血淋巴，用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進行蛋白純化，獲得最終的重組蓖麻毒素蛋白A鏈蛋白。

2.根據權利要求1所述的一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，利用RT-PCR系統一步克隆具體如下：引物設計如下：正向引物：5'-AGGGATCCCCATTCCCCAAATA-3'，含有BamHI酶切位點，反向引物：5'-GAAGCTTTAAAAACTGTGACGATGGT-3'，含有HindIII酶切位點；PCR反應的循環數、溫度和時間的設計如下：一個循環，94℃模板變性2分鐘；10個循環，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘；25個循環，94℃變性10秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘；最后1個循環，68℃延伸7分鐘；然后利用1％瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物分析，并用PCR純化試劑盒純化，隨后將PCR產物克隆入載體PCR2.1，獲得PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A鏈。

3.根據權利要求1所述的一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，載體PCR2.1為Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的載體PCR2.1。

4.根據權利要求1所述的一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法，其特征在于：所述步驟(2)具體為：在離心管中加入1μg的pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A鏈DNA和15μg的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)DNA，混勻，并加入14μl的脂質體(lipofectin)，再加入滅菌蒸餾水至終體積40μl，獲得混合物；然后將混合物在常溫培育15分鐘后共轉染對數生長期的BmN培養細胞，用無血清的TC-100培養基培養24小時后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養基在27℃培養5天，收集培養基上清作為病毒儲存原液，用病毒儲存原液通過空斑篩選，最終獲得重組病毒溶液，濃度為10⁸pfu/ml。

5.根據權利要求1所述的一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，以家蠶幼蟲的血淋巴作為重組蓖麻毒素蛋白A鏈純化的起始材料，具體使用以下方法從家蠶幼蟲中收集血淋巴：收集管預先加入占據收集管1/10體積的10mmol/L的二硫蘇糖醇DTT(分子式為C4H10O₂S₂)，在收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一只手固定幼蟲的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊；用25號針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進收集管中。

6.根據權利要求1所述的一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進行蛋白純化，具體為：將收集的血淋巴用非變性結合緩沖液進行稀釋，非變性結合緩沖液含有Na₃PO₄ 50mmol/L、NaCl 0.5mol/L且pH8.0，稀釋后將溶液結合于Ni-NTA親和柱，再在非變性結合緩沖液中加入250mmol/L咪唑獲得非變性洗脫緩沖液，用非變性洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液作為重組蓖麻毒素蛋白A鏈蛋白的溶液。