[發明專利]一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法

在審

• 申請號: 201910345204.1
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110129332A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: 吳小鋒;張健家;沈運旺
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/866;C07K14/415;C07K1/22
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發明公開了一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法。以蓖麻籽抽提獲得的總RNA為模板PCR處理獲得蓖麻毒素蛋白A鏈基因的PCR產物；利用家蠶核型多角體病毒BmNPV作為載體，構建了含有蓖麻毒素蛋白A鏈基因的重組病毒，利用家蠶作為重組桿狀病毒的宿主表達具有生物活性的重組蓖麻毒素蛋白A鏈。本發明以家蠶作為宿主生產重組蓖麻毒素蛋白A鏈，具有較強的生物活性，有利于蛋白質的快速提取，為該蛋白A鏈在醫學和治療領域上的應用提供了新的途徑。

技術領域

本發明涉及DNA重組技術、蛋白質的表達方法，尤其是涉及利用家蠶桿狀病毒表達系統表達生產重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法。

背景技術

蓖麻毒素是從蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64,000。毒素由A和B兩條多肽鏈組成，兩鏈間由一個二硫鍵連接。目前，A鏈和B鏈的氨基酸序列以及二級結構已清楚。毒素A鏈由263個氨基酸組成，分子量大小32KDa，毒素B鏈上含有兩個半乳糖或半乳糖殘基結合位點，可和細胞表面的含半乳糖殘基的受體結合，通過內陷作用進入細胞質，發揮毒性作用。蓖麻毒素A、B鏈上還分別含有1和2個糖支鏈，鏈末端均為甘露糖殘基，可以和網狀內皮細胞特別是巨噬細胞結合。后者細胞表面富含甘露糖受體，可優先攝取蓖麻毒素，這對于毒素發揮生物功能有重要的作用。

蓖麻該毒素易損傷肝、腎等實質器官，發生出血、變性、壞死病變。并能凝集和溶解紅細胞，抑制麻痹心血管和呼吸中樞，是致死的主要原因之一。但目前最新的研究發現，該毒素具有誘導細胞凋亡的作用，因此，通過靶向作用，該毒素在腫瘤治療領域有很好的應用前景。

鑒于該毒素在蓖麻中的含量極低，加上提純難度大，因此，十分有必要進行體外表達，開發一種高效且經濟的方法進行生產。由于該毒素毒性大，一般的表達系統，如大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞等表達水平較低，另外由于該蛋白需要糖基化，大腸桿菌等原核表達系統修飾差，所以在上述系統中的表達均不理想。

發明內容

為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的在于提供了一種家蠶表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈的方法，以家蠶作為宿主生產重組蓖麻毒素蛋白A鏈，利用家蠶桿狀病毒表達系統在家蠶內表達該毒素蛋白A鏈。具體是利用BmNPV構建含有蓖麻毒素蛋白A鏈基因的重組病毒，并利用家蠶作為宿主，表達生產重組蓖麻毒素蛋白A鏈，具有成本低、表達水平高的特點。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案其步驟如下：

(1)蓖麻毒素蛋白A鏈編碼基因的克隆：以蓖麻籽抽提獲得的總RNA為模板，利用RT-PCR系統一步克隆獲得蓖麻毒素蛋白A鏈基因的PCR產物；

(2)含有蓖麻毒素蛋白A鏈基因的重組桿狀病毒的構建：用限制性內切酶BamHI和HindIII消化PCR2.1-蓖麻毒素蛋白A鏈得到蓖麻毒素蛋白A鏈基因片段，然后將蓖麻毒素蛋白A鏈基因片段克隆入桿狀病毒轉移載體pBlueBacHisA獲得重組體pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A鏈；通過共轉染在家蠶培養細胞BmN內將重組體pBlueBacHisA-蓖麻毒素蛋白A鏈與家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的基因同源重組產生重組病毒；

(3)家蠶體內表達重組蓖麻毒素蛋白A鏈：使用家蠶幼蟲5齡起蠶，經口接種上述重組病毒進行感染表達，將涂布有病毒液的桑葉飼喂家蠶，然后在23-25℃下飼養；在飼養96小時后收集家蠶幼蟲；從家蠶幼蟲中收集血淋巴，用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進行蛋白純化，獲得最終的重組蓖麻毒素蛋白A鏈蛋白。