[發(fā)明專利]原代星形膠質(zhì)細(xì)胞/原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵代謝研究中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910345162.1
• 申請(qǐng)日: 2019-04-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110205294B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝俊霞;王俊;許曼曼
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079;A61K35/30;A61P25/16
• 代理公司: 青島清泰聯(lián)信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37256
• 代理人: 李祺;張潔

本發(fā)明提出一種原代星形膠質(zhì)細(xì)胞/原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵代謝研究中的應(yīng)用，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)方案通過(guò)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法檢測(cè)該共培養(yǎng)體系，可在細(xì)胞層面明確神經(jīng)元鐵的來(lái)源、其與星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互影響，以及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的方向性問(wèn)題。本發(fā)明建立的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞與原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系是一種新的研究帕金森病的細(xì)胞模型，可用于研究帕金森病等神經(jīng)退行性疾病腦內(nèi)高鐵的相關(guān)研究中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種原代星形膠質(zhì)細(xì)胞/原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵代謝研究中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種多發(fā)于中老年的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理學(xué)特征為黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元缺失。近年來(lái)，腦內(nèi)高鐵導(dǎo)致黑質(zhì)－紋狀體系統(tǒng)DA能神經(jīng)元功能的損傷已成為越來(lái)越受到神經(jīng)科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前PD鐵沉積的研究主要集中在DA能神經(jīng)元，鐵負(fù)載時(shí)，神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞有鐵沉積，而星形膠質(zhì)細(xì)胞卻在同樣的情況下沒(méi)有鐵沉積。那么，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦鐵代謝以及PD黑質(zhì)鐵聚積過(guò)程中是如何發(fā)揮作用的是進(jìn)一步研究PD病人中腦內(nèi)高鐵以及鐵沉積分布區(qū)域不同的關(guān)鍵。

目前，研究星形膠質(zhì)細(xì)胞和DA能神經(jīng)元鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的研究方法，主要是利用激光共聚焦顯微鏡，與鈣黃綠素結(jié)合，實(shí)時(shí)觀察鐵轉(zhuǎn)入細(xì)胞與轉(zhuǎn)出細(xì)胞的速率。此種方法雖然可以高效實(shí)時(shí)觀察其鐵轉(zhuǎn)運(yùn)速率的變化，但無(wú)法研究星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，無(wú)法確定神經(jīng)元中過(guò)多的鐵的來(lái)源，也無(wú)法確定不同細(xì)胞中的鐵含量。星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵轉(zhuǎn)運(yùn)是如何相互影響的，鐵沉積的鐵的來(lái)源，各細(xì)胞中鐵含量等仍是目前亟需探討的關(guān)鍵問(wèn)題。

在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，目前應(yīng)用星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)體系的研究主要集中在神經(jīng)元突觸的發(fā)育，細(xì)胞的遷徙、浸潤(rùn)，形態(tài)學(xué)及代謝產(chǎn)物的研究，且主要集中在海馬和皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的研究。并且，在中腦及帕金森病中的研究較少，且主要集中在了神經(jīng)炎癥對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷、凋亡等的研究和星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)因子的保護(hù)作用，而在鐵代謝中的研究較少。在體外研究中，并未見(jiàn)利用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和中腦腹側(cè) (ventral mesencephalon,VM)神經(jīng)元共培養(yǎng)系統(tǒng)用于鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的相互影響，及鐵代謝的相關(guān)研究報(bào)道。

因此，構(gòu)建中腦原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和VM神經(jīng)元共培養(yǎng)系統(tǒng)，建立一種新型的帕金森病的細(xì)胞模型，以在細(xì)胞層面明確神經(jīng)元鐵的來(lái)源、其與星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互影響，以及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的方向性對(duì)于本領(lǐng)域而言尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種原代星形膠質(zhì)細(xì)胞/原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵代謝研究中的應(yīng)用，通過(guò)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法檢測(cè)該共培養(yǎng)體系，可在細(xì)胞層面明確神經(jīng)元鐵的來(lái)源、其與星形膠質(zhì)細(xì)胞間的相互影響，以及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的方向性問(wèn)題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種原代星形膠質(zhì)細(xì)胞/原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵代謝中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，包括以下步驟：

利用10μM 6-OHDA分別預(yù)孵育接種于Transwell上室的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和接種于Transwell下室的原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元24h；然后利用1mM外源性鐵FAC繼續(xù)孵育接種于Transwell上室的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞30min；

將上室的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基和下室的原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元的培養(yǎng)基同時(shí)更換為原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元的完全培養(yǎng)基，并將上室放入下室的孔板中共培養(yǎng)30min，檢測(cè)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和中腦腹側(cè)神經(jīng)元中Fe²⁺的含量。

作為優(yōu)選，將上室放入下室的孔板中對(duì)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元進(jìn)行共培養(yǎng)前還包括共培養(yǎng)體系建立的步驟，具體包括以下步驟：