[發(fā)明專利]原代星形膠質(zhì)細(xì)胞/原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵代謝研究中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910345162.1
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110205294B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝俊霞;王俊;許曼曼
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;A61K35/30;A61P25/16
• 代理公司: 青島清泰聯(lián)信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37256
• 代理人: 李祺;張潔

1.原代星形膠質(zhì)細(xì)胞/原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元共培養(yǎng)體系在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元間鐵代謝研究中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：利用10μM 6-OHDA分別預(yù)孵育接種于Transwell上室的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和接種于Transwell下室的原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元24h；然后利用1mM外源性鐵FAC繼續(xù)孵育接種于Transwell上室的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞30min；

將上室的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液和下室的原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元接種培養(yǎng)液同時(shí)更換為原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元完全培養(yǎng)液，并將上室放入下室的孔板中共培養(yǎng)30min，檢測原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和中腦腹側(cè)神經(jīng)元中Fe²⁺的含量；

其中，所述Transwell為具有通透性的杯狀裝置，Transwell嵌套于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)板中，Transwell的內(nèi)部為上室，Transwell以外、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)板以內(nèi)為下室，Transwell的底部由孔徑為0.4μm的PET膜構(gòu)成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將上室放入下室的孔板中對原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和原代培養(yǎng)的中腦腹側(cè)神經(jīng)元進(jìn)行共培養(yǎng)前還包括共培養(yǎng)體系建立的步驟，具體包括以下步驟：

原代培養(yǎng)：從試驗(yàn)動物中提取分離原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，重懸沉淀，篩選后，用胰酶消化、并用星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化，然后加入星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液進(jìn)行差速粘附處理，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于預(yù)先用多聚賴氨酸處理的Transwell上室中；從試驗(yàn)動物中提取分離原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元，重懸沉淀，篩選后，加入中腦腹側(cè)神經(jīng)元接種培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度后，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸處理的Transwell下室中；

共培養(yǎng)：在原代中腦腹側(cè)神經(jīng)元接種4-5天后，將胰酶消化并純化的第3代星形膠質(zhì)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以0.7×10⁶/ml將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到Transwell上室中，待上室星形膠質(zhì)細(xì)胞和下室中腦腹側(cè)神經(jīng)元長好，將上室和下室內(nèi)的培養(yǎng)基同時(shí)更換為中腦腹側(cè)神經(jīng)元完全培養(yǎng)液，并將上室放入下室的孔板中，建立共培養(yǎng)體系。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，將上室和下室內(nèi)的培養(yǎng)基同時(shí)更換為中腦腹側(cè)神經(jīng)元完全培養(yǎng)液，建立共培養(yǎng)體系時(shí)，向上室加入0.5ml中腦腹側(cè)神經(jīng)元完全培養(yǎng)液，向下室加入1.5ml中腦腹側(cè)神經(jīng)元完全培養(yǎng)液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，中腦腹側(cè)神經(jīng)元完全培養(yǎng)液由體積比1:1的DMEM/F-12基本培養(yǎng)液200ml、2％B27、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素構(gòu)成。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液由體積比1:1的DMEM/F-12基本培養(yǎng)液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素構(gòu)成；中腦腹側(cè)神經(jīng)元接種培養(yǎng)液由體積比1:1的DMEM/F-12基本培養(yǎng)液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素構(gòu)成。