[發明專利]原代星形膠質細胞/原代中腦腹側神經元共培養體系在星形膠質細胞與神經元間鐵代謝研究中的應用

有效

• 申請號: 201910345162.1
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110205294B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 謝俊霞;王俊;許曼曼
• 申請（專利權）人: 青島大學
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;A61K35/30;A61P25/16
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 李祺;張潔

1.原代星形膠質細胞/原代中腦腹側神經元共培養體系在星形膠質細胞與神經元間鐵代謝研究中的應用，其特征在于，包括以下步驟：利用10μM 6-OHDA分別預孵育接種于Transwell上室的原代培養的星形膠質細胞和接種于Transwell下室的原代培養的中腦腹側神經元24h；然后利用1mM外源性鐵FAC繼續孵育接種于Transwell上室的原代培養的星形膠質細胞30min；

將上室的原代培養的星形膠質細胞完全培養液和下室的原代培養的中腦腹側神經元接種培養液同時更換為原代培養的中腦腹側神經元完全培養液，并將上室放入下室的孔板中共培養30min，檢測原代培養的星形膠質細胞和中腦腹側神經元中Fe²⁺的含量；

其中，所述Transwell為具有通透性的杯狀裝置，Transwell嵌套于常規細胞培養板中，Transwell的內部為上室，Transwell以外、常規細胞培養板以內為下室，Transwell的底部由孔徑為0.4μm的PET膜構成。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，將上室放入下室的孔板中對原代培養的星形膠質細胞和原代培養的中腦腹側神經元進行共培養前還包括共培養體系建立的步驟，具體包括以下步驟：

原代培養：從試驗動物中提取分離原代星形膠質細胞，重懸沉淀，篩選后，用胰酶消化、并用星形膠質細胞完全培養液終止消化，然后加入星形膠質細胞完全培養液進行差速粘附處理，調整細胞濃度后接種于預先用多聚賴氨酸處理的Transwell上室中；從試驗動物中提取分離原代中腦腹側神經元，重懸沉淀，篩選后，加入中腦腹側神經元接種培養液調整細胞濃度后，接種于預先用多聚賴氨酸處理的Transwell下室中；

共培養：在原代中腦腹側神經元接種4-5天后，將胰酶消化并純化的第3代星形膠質細胞制成細胞懸液，以0.7×10⁶/ml將星形膠質細胞接種到Transwell上室中，待上室星形膠質細胞和下室中腦腹側神經元長好，將上室和下室內的培養基同時更換為中腦腹側神經元完全培養液，并將上室放入下室的孔板中，建立共培養體系。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，將上室和下室內的培養基同時更換為中腦腹側神經元完全培養液，建立共培養體系時，向上室加入0.5ml中腦腹側神經元完全培養液，向下室加入1.5ml中腦腹側神經元完全培養液。

4.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于，中腦腹側神經元完全培養液由體積比1:1的DMEM/F-12基本培養液200ml、2％B27、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素構成。

5.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于，星形膠質細胞完全培養液由體積比1:1的DMEM/F-12基本培養液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素構成；中腦腹側神經元接種培養液由體積比1:1的DMEM/F-12基本培養液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素構成。