[發明專利]川桑色氨酸羥化酶T5H2及其應用

在審

• 申請號: 201910342321.2
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN111849931A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 趙愛春;鄭莎;劉長英;朱映雪;張帥;夏中強;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12P17/10
• 代理公司: 重慶航圖知識產權代理事務所(普通合伙) 50247
• 代理人: 王貴君

本發明公開了川桑色氨酸羥化酶T5H2及其應用，其中川桑色氨酸羥化酶T5H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，含有532個氨基酸，PI＝4.93，將川桑色氨酸羥化酶T5H2基因克隆后構建原核表達系統，表達后進行酶活測定，測得具有較高的色氨酸羥化酶活性，因此川桑色氨酸羥化酶T5H2可以作為工程菌的基因，表達的重組川桑色氨酸羥化酶T5H2也可以作為體外催化色胺轉化為5?色胺的催化劑，然后過不同的途徑有效的合成相應產物，最后有效的合成褪黑素，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及川桑色氨酸羥化酶T5H2，還涉及川桑色氨酸羥化酶T5H2及其應用的應用。

背景技術

褪黑素，學名N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，是一種吲哚胺，色氨酸的代謝產物。目前已知它廣泛存在于人體、動物體及植物體內，生理作用非常廣泛。由于其首先在人體的松果體內被發現，因此又被稱為松果體素。隨后的研究發現，其廣泛存在于人體內的各個部位，含量極少，只有pg(1×10^-12g)/mL水平。目前已知的褪黑素的生理功能主要有調節生物體的晝夜節律，緩解睡眠障礙；抗氧化，褪黑素本身及其代謝產物不僅有強大的自由基清除能力，而且能夠誘導生物體相關抗氧化酶活性增強，增強免疫作用，抗腫瘤，抗衰老，特別是對阿爾茨海默病有明顯效果等優點。

長期以來褪黑素被認為是動物體內專有的，自從1995年在植物中檢測到褪黑素之后，人們陸續在許多高等植物中也發現褪黑素存在。在動物中，褪黑素的生物合成途徑已經非常清楚。在植物中褪黑素的合成途徑包括3條：(1)色氨酸脫羧酶將色氨酸轉化成色胺；色氨酸羥化酶將色胺轉化為5-羥色胺；N-乙酰-5羥色胺轉移酶將5-羥色胺轉化為N-乙酰-5羥色胺；N-乙酰-5-羥色胺氧甲基轉移酶或者咖啡酸氧甲基轉移酶將N-乙酰-5羥色胺轉化成褪黑素。(2)色氨酸脫羧酶將色氨酸轉化成色胺；N-乙酰-5羥色胺轉移酶將色胺轉化為N-乙酰-5羥色胺；N-乙酰色胺氧甲基轉移酶將N-乙酰-5羥色胺轉化成褪黑素。(3)色氨酸脫羧酶將色氨酸轉化成色胺；色氨酸羥化酶將色胺轉化為5-羥色胺；N-乙酰-5-羥色胺氧甲基轉移酶或者咖啡酸氧甲基轉移酶將5-羥色胺轉化成5-甲氧基-色胺；N-乙酰色胺轉移酶將5-甲氧基-色胺轉化成褪黑素。

色氨酸羥化酶基因(T5H2)是褪黑素合成過程中的第二個限速酶，該反應高度特異，是褪黑素合成中的重要酶促步驟。川桑中含有褪黑素，但是其含量極低，并不能大量提取獲得。因此，研究褪黑素合成途徑的色氨酸羥化酶基因及其基因，有利于體外合成途徑的建立，為褪黑素規模化生產點奠定基礎。

發明內容

有鑒于此，本發明通過分子生物學技術，克隆出褪黑素合成相關酶色氨酸羥化酶T5H2基因，分析該基因的核苷酸和翻譯的氨基酸序列，采用大腸桿菌原核表達系統進行褪黑素合成相關酶色氨酸羥化酶T5H2的功能驗證。用發酵的產物純化、得到相關的色氨酸羥化酶蛋白直接體外依次合成褪黑素前體5-羥色胺。即本發明的目的之一在于提供一種川桑色氨酸羥化酶T5H2；本發明的目的之二在于提供一種川桑色氨酸羥化酶基因T5H2；本發明的目的之三在于提供所述川桑色氨酸羥化酶T5H2在制備色胺轉化為5-羥色胺的催化劑中的應用；本發明的目的之四在于提供所述川桑色氨酸羥化酶基因T5H2在原核生物中重建褪黑素合成途徑中的應用；本發明的目的之五在于提供一種制備重組川桑色氨酸羥化酶T5H2的方法；本發明的目的之六在于提供由權所述的方法制得的重組川桑色氨酸羥化酶T5H2；本發明的目的之七在于提供所述重組川桑氨酸羥化酶T5H2在制備色胺轉化為5-羥色胺的催化劑中的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、一種川桑色氨酸羥化酶T5H2，所述色氨酸羥化酶T5H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

優選的，編碼川桑色氨酸羥化酶T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、一種川桑色氨酸羥化酶基因T5H2，所述川桑色氨酸羥化酶基因T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。