[發明專利]一種基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法

有效

• 申請號: 201910341109.4
• 申請日: 2019-04-25
• 公開（公告）號: CN109975561B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 牛凌梅;康維鈞;王艷仙
• 申請（專利權）人: 河北醫科大學
• 主分類號: G01N33/94
• 分類號: G01N33/94;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

本發明提供了一種基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法，首先將ssDNA1與多巴胺適配體、ssDNA2通過堿基互補配對原則結合形成具有兩個3’突出末端的雙鏈DNA1，其中，ssDNA2的堿基數少于ssDNA1并與ssDNA1互補配對，多巴胺適配體自ssDNA2的3’末端開始與ssDNA1部分互補配對；之后加入待測樣品、發夾DNA、熒光染料SYBR GreenⅠ以及核酸外切酶Ⅲ，其中，所述發夾DNA的堿基數少于ssDNA1并能與游離的ssDNA1通過堿基互補配對原則形成發夾DNA鏈3’末端凹陷的雙鏈DNA2。本發明通過多巴胺適配體識別多巴胺，使適配體從雙鏈DNA1中脫離，從而不斷引發酶切反應，熒光信號降低，利用此循環放大技術實現了對多巴胺的超靈敏檢測。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，具體涉及一種基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法。

背景技術

帕金森病是一種常見的神經功能障礙疾病，主要影響中老年人，是繼腫瘤、心腦血管病之后中老年的“第三殺手”。令人驚訝的是，全球大約450萬帕金森病患者，近一半在中國。而帕金森病最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡，由此而引起紋狀體多巴胺（DA）含量顯著性減少而致病。因此，檢測多巴胺等神經遞質對于保障國民健康及疾病的治療與預防都具有重要意義。

然而，由于多巴胺（DA）在血液中含量較低，現有檢測方法不易實現靈敏檢測。另一方面體液中通常存在著多種物質，例如抗壞血酸、腎上腺素、去甲腎上腺素等，這些物質都有可能會影響多巴胺的測定。因此，研究一種選擇性好的識別探針很有必要。其次，采樣問題也是一個亟待解決的方面。多巴胺的采集多通過取血，也有腦脊液取樣。這些部位的取樣存在著對機體創傷大，病人依從性差等特點。隨著超微量檢測、無創或微創檢測在醫療領域中的發展，研究出一種高靈敏度、高選擇性、微創地檢測多巴胺（DA）的新方法具有重要意義。

目前，測定多巴胺（DA）的主要方法有光譜法，質譜法，熒光法，化學發光法，毛細管電泳法，色譜法，以及電化學方法。例如，Edyta N等利用魯米諾鐵氰化鉀化學發光體系對多巴胺進行了測定。 Andrej K等采用液相色譜質譜聯用的方法對小鼠腦脊液中的神經遞質進行了測定研究。艾永青等用石墨烯修飾的金電極對多巴胺和尿酸進行了同時測定。光學方法檢測雖然方便、快捷，但檢測的靈敏度較差。色譜法雖相對于光學方法靈敏度較高，但前處理繁瑣，儀器昂貴，試劑消耗大，運行成本較高。電化學方法雖然設備簡單，但是檢測靈敏度不高，且電極的使用壽命較短，檢測結果的重現性較差。

發明內容

本發明的目的就是提供一種基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法，以解決現有檢測方法靈敏度差，操作復雜，采用創傷大的問題。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法，首先將ssDNA1與多巴胺適配體、ssDNA2通過堿基互補配對原則結合形成具有兩個3’突出末端的雙鏈DNA1，其中，ssDNA2的堿基數少于ssDNA1并與ssDNA1互補配對，多巴胺適配體自ssDNA2的3’末端開始與ssDNA1部分互補配對；之后加入待測樣品、發夾DNA、熒光染料SYBR Green Ⅰ以及核酸外切酶Ⅲ，其中，所述發夾DNA的堿基數少于ssDNA1并能與游離的ssDNA1通過堿基互補配對原則形成發夾DNA 鏈3’末端凹陷的雙鏈DNA2；

待測樣品中的多巴胺從雙鏈DNA1中競爭得到多巴胺適配體，使得剩余的雙鏈DNA1形成3’末端凹陷的結構，從而引發核酸外切酶 Ⅲ 的酶切反應形成游離的ssDNA1，發夾DNA（hDNA）與游離的ssDNA1通過堿基互補配對原則形成發夾DNA 鏈3’末端凹陷的雙鏈DNA2，進而再次引發核酸外切酶 Ⅲ的酶切反應，如此循環使得位于雙鏈DNA結構中的熒光染料SYBRGreen Ⅰ不斷被釋放出來，導致熒光信號減小，通過熒光信號的減少量與多巴胺濃度的線性關系得到待測樣品的多巴胺濃度。

上述的基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法具體包括以下步驟：