[發(fā)明專利]一種基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910341109.4
• 申請日: 2019-04-25
• 公開（公告）號: CN109975561B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發(fā)明（設計）人: 牛凌梅;康維鈞;王艷仙
• 申請（專利權）人: 河北醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N33/94
• 分類號: G01N33/94;G01N33/533;G01N21/64
• 代理公司: 石家莊國域?qū)＠虡耸聞账邢薰?13112
• 代理人: 白海靜

1.一種基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法，其特征是，首先將ssDNA1與多巴胺適配體、ssDNA2通過堿基互補配對原則結合形成具有兩個3’突出末端的雙鏈DNA1，其中，ssDNA2的堿基數(shù)少于ssDNA1并與ssDNA1互補配對，多巴胺適配體自ssDNA2的3’末端開始與ssDNA1部分互補配對；之后加入待測樣品、發(fā)夾DNA、熒光染料SYBR Green Ⅰ以及核酸外切酶Ⅲ，其中，所述發(fā)夾DNA的堿基數(shù)少于ssDNA1并能與游離的ssDNA1通過堿基互補配對原則形成發(fā)夾DNA 鏈3’末端凹陷的雙鏈DNA2；

待測樣品中的多巴胺從雙鏈DNA1中競爭得到多巴胺適配體，使得剩余的雙鏈DNA1形成3’末端凹陷的結構，從而引發(fā)核酸外切酶 Ⅲ 的酶切反應形成游離的ssDNA1，發(fā)夾DNA與游離的ssDNA1通過堿基互補配對原則形成發(fā)夾DNA 鏈3’末端凹陷的雙鏈DNA2，進而再次引發(fā)核酸外切酶 Ⅲ的酶切反應，如此循環(huán)使得位于雙鏈DNA結構中的熒光染料SYBR Green Ⅰ不斷被釋放出來，導致熒光信號減小，通過熒光信號的減少量與多巴胺濃度的線性關系得到待測樣品的多巴胺濃度；所述方法具體包括以下步驟：

a、將等摩爾量的多巴胺適配體、ssDNA1、ssDNA2加入到Tris-HCl溶液中，室溫條件下進行孵育，然后加入待測樣品，并在室溫條件下進行反應；其中，多巴胺適配體序列如序列表中的序列1所示，ssDNA1序列如序列表中的序列2所示，ssDNA2序列如序列表中的序列3所示；

b、向步驟a得到的反應液中加入發(fā)夾DNA和熒光染料SYBR Green Ⅰ溶液，反應完全后，加入核酸外切酶Ⅲ進行酶切反應，反應完成后冷卻至室溫；其中，發(fā)夾DNA序列如序列表中的序列4所示；

c、用熒光分光光度計對步驟b得到的反應液進行檢測，獲得待測樣品對應的熒光信號的減少量，再通過預先測得的熒光信號的減少量與多巴胺濃度的標準曲線獲得待測樣品的多巴胺濃度。

2.根據(jù)權利要求1所述的基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法，其特征是，步驟a中，多巴胺適配體、ssDNA1、ssDNA2的孵育時間為5小時。

3.根據(jù)權利要求1所述的基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法，其特征是，步驟b中，酶切反應條件為：加入70U 核酸外切酶Ⅲ，于37℃孵育1小時。

4.根據(jù)權利要求1所述的基于核酸適配體的超靈敏檢測多巴胺的方法，其特征是，步驟c中，熒光分光光度計的激發(fā)波長為497nm，熒光發(fā)射光譜在510~600nm檢測，激發(fā)和發(fā)射狹縫為10.0 nm，溫度為25℃。