[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于檢測(cè)鼠痘病毒的RPA試劑盒、引物、探針及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910338683.4
• 申請(qǐng)日: 2019-04-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111850099A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊煒;薛俊欣;魏曉鋒;林穎崢;李健
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心;上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6844
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/70;C12N15/11
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)鼠痘病毒核酸的RPA試劑盒、引物、探針及方法。本發(fā)明的試劑盒包括RPA反應(yīng)體系，所述的RPA反應(yīng)體系包括RPA引物探針混合液，所述RPA引物探針混合液包括一引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探針如SEQ ID NO.3+FAM?dt+THF+BHQ1?dt+SEQ ID NO.4+C3所示。本發(fā)明的試劑盒可用于檢測(cè)鼠痘病毒，反應(yīng)時(shí)間短、檢測(cè)速度快，且靈敏度和特異性高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)鼠痘病毒核酸的RPA試劑盒、引物、探針及方法。

背景技術(shù)

資料公開(kāi)了由鼠痘病毒(Ectromelia virus，EV)引起的小鼠鼠痘(Mouse pox)是一種高度接觸性、毀滅性的烈性傳染病，該病在世界各地的實(shí)驗(yàn)鼠群廣泛流行，死亡率達(dá)96.6％。該疾患其臨床以四肢、頭和尾腫脹、壞死甚至腳趾脫落為特征，是危害小鼠最為嚴(yán)重的病毒病之一。英國(guó)Marchal等于1929年首先在英國(guó)實(shí)驗(yàn)鼠群中發(fā)現(xiàn)本病患，并于次年首次報(bào)道；我國(guó)湯飛凡1951年首次報(bào)道北京中央生物制品研究所發(fā)生鼠痘疫情；吳惠英等(1986)、徐蓓等(1989)對(duì)全國(guó)各地鼠群進(jìn)行血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，證實(shí)鼠痘在我國(guó)鼠群中呈散發(fā)性流行。目前本病患廣泛存在于世界各國(guó)，尤以英德美法最為嚴(yán)重，在我國(guó)至今仍時(shí)有發(fā)生。研究顯示，本病多呈爆發(fā)性流行，致死率高，常造成全群淘汰，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)繁育，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和科研數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性造成極其嚴(yán)重的影響。研究顯示，在自然條件下，鼠痘病毒可感染各種年齡的小鼠，但以乳鼠和1歲以上的老齡鼠病死率較高，而6～12周齡的小鼠較低，不同品系小鼠的易感性上有所差異；由于鼠痘病毒能隱性感染，小鼠不表現(xiàn)臨床癥狀，但病毒能持久存在于體內(nèi)并且繁殖，而且病毒不斷地從糞便中排出，成為可怕的感染源，因此，對(duì)鼠痘的早期診斷尤其對(duì)隱性感染鼠的檢出，顯得尤其重要。

現(xiàn)有技術(shù)中，血清學(xué)方法和PCR方法是檢測(cè)EV最常用的方法，然而，該兩種方法方法或需要昂貴的儀器設(shè)備，或需要技術(shù)嫻熟的技術(shù)人員，或檢測(cè)周期長(zhǎng)，因此，不適合普通實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)診斷的推廣應(yīng)用。

2006年，一種新等溫基因擴(kuò)增技術(shù)——重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinasepolymerase amplification，RPA)被發(fā)明，該技術(shù)可在37～42℃條件下、10～30min內(nèi)等溫體外大量擴(kuò)增目的基因片段；隨后，英國(guó)TwistDx公司開(kāi)發(fā)出了RPA商品化試劑盒，加快了RPA技術(shù)的研發(fā)、推廣和應(yīng)用；與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相比，PRA具有擴(kuò)增速度快、反應(yīng)溫度恒定、所需儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于DNA或RNA的快速檢測(cè)。目前，RPA已經(jīng)在病毒、衣原體、支原體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原檢測(cè)方面得到了開(kāi)發(fā)與應(yīng)用；該技術(shù)通過(guò)利用重組酶結(jié)合引物形成蛋白-DNA混合物，啟動(dòng)尋找模板DNA上的同源序列；當(dāng)同源序列定位后，則會(huì)引發(fā)鏈置換反應(yīng)；引物結(jié)合到對(duì)應(yīng)模板上，聚合酶進(jìn)而從引物3’末端開(kāi)始啟動(dòng)DNA合成，實(shí)現(xiàn)在常溫下兩條引物對(duì)靶基因的幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增；同時(shí)，在RPA反應(yīng)體系中，對(duì)引物堿基突變具有較強(qiáng)的耐受性，在引物個(gè)別堿基突變后，RPA反應(yīng)依然可以順利進(jìn)行。

實(shí)踐顯示，重組酶聚合酶擴(kuò)增是一種可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)，其能在20分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)；該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合野外及檢疫現(xiàn)場(chǎng)使用。

基于現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)與現(xiàn)狀，為加強(qiáng)口岸對(duì)入境噬齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和野生動(dòng)物鼠痘疫情的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，本申請(qǐng)?jiān)诮?shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)EV的方法以及對(duì)該方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，提供一種用于檢測(cè)鼠痘病毒的RPA試劑盒、引物、探針及方法。

發(fā)明內(nèi)容