[發明專利]一種用于檢測鼠痘病毒的RPA試劑盒、引物、探針及方法

在審

• 申請號: 201910338683.4
• 申請日: 2019-04-25
• 公開（公告）號: CN111850099A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 熊煒;薛俊欣;魏曉鋒;林穎崢;李健
• 申請（專利權）人: 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心;上海實驗動物研究中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70;C12N15/11
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.一種用于檢測鼠痘病毒核酸的試劑盒，其包括RPA反應體系，其特征在于，所述的RPA反應體系包括RPA引物探針混合液，所述RPA引物探針混合液包括一引物對和探針，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探針如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的RPA反應體系的引物的濃度均為5～20μM，較佳地為10μM；所述探針的濃度為5～10μM，較佳地為10μM。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的RPA反應體系還包括核心反應液、反應緩沖液、Exo反應液、探針酶混合物、醋酸鎂和dNTP；較佳地：所述醋酸鎂的濃度為260～300μM，優選280μM；

和/或，所述dNTP的濃度為20～220μM，優選200μM。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物探針混合液由所述引物對和所述探針組成，所述引物對中各引物的量為2.1μL、濃度為10μM，所述探針的量為0.6μL、濃度為10μM；所述核心反應液的量為2.5μL，所述反應緩沖液的量為25μL，所述探針酶混合物的量為5μL，以及所述Exo反應液的量為1μL；所述醋酸鎂的量為2.5μL、濃度為280μM；所述dNTP的量為7.2μL、濃度為11mM；較佳地：所述的核心反應液為20倍核心反應液；

和/或，所述的反應緩沖液為2倍反應緩沖液；

和/或，所述的探針酶混合物為10倍探針酶混合物；

和/或，所述的Exo反應液為50倍Exo反應液。

5.如權利要求1～4任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括陰性對照，所述的陰性對照優選ddH₂O。

6.一種檢測鼠痘病毒核酸的引物對，其特征在于，所述的引物對的核苷酸序列分別如序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；較佳地，所述的檢測為RPA檢測。

7.一種檢測鼠痘病毒核酸的探針，其特征在于，所述的探針如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；較佳地，所述的檢測為RPA檢測。

8.一種檢測鼠痘病毒核酸的組合，所述的組合包括引物對和探針，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列分別如序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探針如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；較佳地，所述的檢測為RPA檢測。

9.如權利要求6所述的引物對和/或如權利要求7所述的探針，或權利要求8所述的組合在制備檢測鼠痘病毒的試劑盒中的應用。

10.一種非診斷目的的檢測鼠痘病毒的方法，其特征在于，其包括步驟：

(1)使用DNA提取試劑提取待檢樣品中的總DNA；

(2)以步驟(1)提取的總DNA為模板，用權利要求1～5任一項所述試劑盒中的RPA反應體系進行RPA反應，所述RPA反應中擴增反應的時間優選25min、溫度優選39℃；

(3)分析檢測結果。