[發明專利]一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌

在審

• 申請號: 201910336138.1
• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號: CN110527642A
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 謝晶;沈勇;劉文茹;梅俊;王金鋒
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌，其特征在于：該菌株能夠產生具有抑菌作用的物質，該菌株于2019年01月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.17173。

2.根據權利要求1所述的一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌的篩選方法，其特征在于：以花鱸魚腸道為來源，篩選具有生物拮抗作用的菌，并研究對比其抑菌效果和抑菌譜；具體操作步驟如下：

(1) 從水產品市場購買花鱸魚后，半小時內4℃低溫保鮮盒運送至實驗室；

(2)在無菌環境下取出花鱸魚腸道，并用無菌手術剪刀將其充分剪碎混勻，加入含有25mL的無菌生理鹽水中重復充分振蕩搖勻，制成原液；吸取1 mL做梯度稀釋；

(3)取(2)中所提及的原液和進行的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀釋的菌液涂布于含有溴甲酚紫的MRS固體培養基上，再在30 ℃培養48-84 h, 用接種針挑取MRS平板上黃色的單菌落，在MRS平板上劃線分離，傳代培養2~4次直至純化；對每株菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗后，選擇革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株保存；

(4)將保存的菌株活化后，以1~5%接種量接種于MRS肉湯培養基中，在30℃下靜置培養24-48h，將發酵液在6000~12000 r/min下離心10-30 min，得到無細胞上清液，再進行凍干保存、備用；

（5）在BHI液體培養基中分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，在溫度為30 ℃，轉速為120 r/min的搖床下培養12小時，使得大腸桿菌和金黃色葡萄球菌處于生長的對數期，獲得了大腸桿菌的菌液和金黃色葡萄球菌的菌液；

（6）將凍干后的無細胞上清液加入無菌超純水進行復溶；進行抑菌試驗時，將凍干的無細胞上清液復溶；復溶后的濃度為凍干前濃度的10倍；

（7）分別取1 mL大腸桿菌的菌液和金黃色葡萄球菌的菌液梯度稀釋至稀釋度為10^-3；分別取100 μL稀釋度為10^-3的菌液均勻涂布在PCA平板中，再在無菌條件下將內徑為6 mm，外徑為8 mm的牛津杯放置在PCA平板上，然后吸取200 μL復溶后的無細胞上清液于杯中，30℃培養12-24 h，觀察其是否有抑菌圈，明確其抑菌能力，并用游標卡尺測量其抑菌圈的大小；

(8) 提取菌株的DNA，進行16S rDNA的PCR擴增與測序，并進行菌株的同源性分析。

3. 根據權利要求2所述的一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌的篩選方法，其特征在于：將原液和10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀釋的菌液分別涂布于含有溴甲酚紫的MRS固體培養基，在30 ℃培養72 h，之后用接種針挑取黃色的單菌落劃線培養傳代培養3次。

4.根據權利要求2所述的一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌的篩選方法，其特征在于：保存的菌種活化后，以2%接種量接種到MRS肉湯培養基中。

5.根據權利要求2所述的一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌的篩選方法，其特征在于：保存的菌種活化并接種到MRS肉湯培養基中，在30 ℃下靜置培養32 h。

6.根據權利要求2所述的一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌的篩選方法，其特征在于：發酵液的離心在轉速為8000 r/min條件下離心20min。

7. 根據權利要求2所述的一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌的篩選方法，其特征在于：使用牛津杯法測定抑菌圈時，在30 ℃下培養14h后觀察。

8.根據權利要求2所述的一種具有生物抗菌作用的糞腸球菌的篩選方法，其特征在于：初步分離菌株后對得到的疑似菌株進行革蘭氏染色試驗和過氧化氫酶接觸試驗，選擇革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株保存。